许氏平鲉肌肉生长发育的初步研究*

王梦娅， 金超凡， 张奉燕， 黄可佳， 贺 艳

(中国海洋大学海洋生命学院，海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室， 山东 青岛 266003)

脊椎动物的肌肉生长分为限定性生长与非限定性生长，如鸟类和哺乳类的肌肉生长模式为典型的限定性生长，它们的肌纤维数量在出生前已经固定，出生后肌肉的生长主要取决于胚胎期形成的肌纤维数量和增加已有肌纤维尺寸的大小[1-4]。不同于鸟类与哺乳类，大多数鱼类的肌肉呈现非限定性生长模式，肌纤维数目不是固定的，兼有肌纤维数目增生(Hyperplasia)和肥大(Hypertrophy)的“马赛克”式生长[5-8]。这种肌纤维增生和肥大对肌肉生长的贡献，会因鱼类种类和最终体型的不同而异[9-11]。如斑马鱼(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)等生长缓慢的小体型鱼类，肌肉生长主要依赖于肌纤维肥大，而不是肌纤维的增生；而生长迅速的大体型鱼类，如牙鲆(Parallichthysolivaceus)，肌肉的生长则既依赖于肌纤维的增生，也依赖于肌纤维的肥大[9, 12-13]。

鱼类肌肉的增生过程分为两个阶段:第一阶段为分层增生，主要发生在胚胎期，为不同类型肌肉分层的过程[14-15]；第二阶段为“马赛克”增生阶段，主要发生在幼鱼阶段，此时肌纤维的横截面会出现大量的新生纤维[16]。有研究指出，不同物种的“马赛克”增生阶段不同，在小型鱼类如斑马鱼、青鳉中，“马赛克”增生时间很短甚至缺失[17-18]。鱼类骨骼肌占体重的40%～60%[19-20]，而在大型的快速生长的鱼类中，增生一直持续到成年期甚至贯穿一生[21-24]，如非洲锤形石首鱼(Atractoscionaequidens)，孵化后前几天增生纤维约占纤维总数的93%，且增生纤维所占比率随着鱼体的发育而逐渐降低，直至达到最大体型[25]。还有一些鱼类在整个胚后发育过程主要依赖肌纤维肥大生长，甚至在肌纤维停止募集后，肥大生长能够持续进行[26]，如金头鲷(Sparusaurata)，从幼鱼到成鱼阶段肌纤维直径发生巨大变化，但其不同的发育阶段肥大生长比率也存在显著差异[27]。

许氏平鲉(Sebastesschlegelii)是一种冷温性底层岩礁肉食性鱼类，因肉质鲜美、营养丰富、抗病力强，已成为中国北方重要的经济鱼类[28-29]。对于许氏平鲉等重要的大型经济鱼类，肌肉生长为生长性状的核心，但目前针对许氏平鲉肌肉生长规律的研究甚少。本研究利用组织切片染色，对不同发育时期许氏平鲉的肌肉生长特征进行观察及统计分析，掌握许氏平鲉肌肉的生长发育规律，对后续研究许氏平鲉肌肉生长发育的分子调控机制提供基础。

1 材料方法

1.1 材料

本实验所用许氏平鲉样品购买于青岛贝宝海洋科技有限公司。取样共计12次，包括许氏平鲉幼鱼至性成熟阶段，分别为30、40、50、60、70、80、90及100 d post-birth (dpb)、1龄鱼以及性成熟后的2、3、4龄鱼。每次对30尾鱼进行体长、体宽及体厚的测量，并进行编号记录。取样之前，使用麻醉剂MS-222(20 mg/L)将其麻醉。幼鱼(各10尾)取背鳍最后一根鳍条后的整个躯干部位，不同年龄的许氏平鲉(各5尾)取背鳍中点以下水平膈肌上方的肌肉样品。样品保存于4%多聚甲醛过夜，梯度甲醇脱水，最后保存在甲醇溶液中置于-20 ℃，用于组织切片制备。

1.2 方法

1.2.1 组织切片的制备 将置于-20 ℃甲醇溶液中的肌肉样品取出，用干净无菌的刀片切成2～3 mm3大小的组织块；经无水乙醇脱水、二甲苯透明，用石蜡将组织块进行包埋，用徕卡RM2016手摇式切片机连续切片，厚度为4～5 μm，经60 ℃水浴展片，37 ℃烘干过夜。将切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，苏木精-伊红HE染色，最后用中性树胶封片，置于室温晾干后保存。

1.2.2 肌纤维形态学观察分析与数据处理 随着许氏平鲉肌肉生长发育，体轴前后、侧线上下部位的肌肉生长存在差异，对于30～100 dpb幼鱼，本文统一选取背鳍起点下背侧第二肌节内的肌纤维进行观察统计。通过肌纤维数目增多与肌纤维面积增大来反映肌纤维增生与肥大生长，将肌纤维面积数据中排序数值较小的部分判定为新增生肌纤维，结合肌纤维的新增数目得到增生面积。肥大面积是指已有肌纤维尺寸增大而增加的面积，运用相对增加面积减增生面积，可得到肥大面积。而增生生长与肥大生长的贡献率分别为增生面积与肥大面积在相对增加面积中所占比例。对于1～4龄的成鱼，很难观察到完成的背部横切面，统一选取背鳍终点下、水平肌隔上方的白肌进行观察统计，每个样本测量300根肌纤维。使用尼康AZ100荧光显微镜观察HE染色结果，NIS-Elements Viewer图像软件统计肌纤维的直径和面积，利用IBM SPSS Statistics 20软件进行数据处理。为了评估许氏平鲉不同年龄白肌中肌纤维增生与肥大的贡献，本研究将肌纤维直径划分为3类：class1，d≤20 μm; class2，20 μm

2 结果

2.1 许氏平鲉幼鱼肌肉生长规律分析

2.1.1 许氏平鲉幼鱼肌纤维形态学观察 为了探究许氏平鲉在幼鱼期的肌肉生长规律，我们对孵化后100 d内共计8个时间点(30、40、50、60、70、80、90及100 dpb)的许氏平鲉的肌肉进行组织切片制备及观察，结果如图1所示，肌纤维的横切面呈现出不规则的多角状(见图1 A～D)。通过观察不同日龄的许氏平鲉肌肉纵切图(见图2 A～D)可以发现，随着许氏平鲉肌肉发育，肌节逐渐变宽。

(A. 30 dpb肌纤维纵切面；B. 60 dpb肌纤维纵切面；C. 80 dpb肌纤维纵切面；D. 100 dpb肌纤维纵切面。标尺均为100 μm。A. Fibers cross section at 30 dpb; B. Fibers cross section at 60 dpb; C. Fibers cross section at 80 dpb; D. Fibers cross section at 100 dpb. Scale bar=100 μm.)

(A.30 dpb肌纤维横切面；B. 60 dpb肌纤维横切面；C. 80 dpb肌纤维横切面；D. 100 dpb肌纤维横切面。标尺均为100 μm。A. Fibers cross section at 30 dpb; B. Fibers cross section at 60 dpb; C. Fibers cross section at 80 dpb; D. Fibers cross section at 100 dpb. Scale bar=100 μm.)

2.1.2 许氏平鲉幼鱼肌纤维形态学统计分析 不同日龄许氏平鲉背侧第二肌节内肌纤维的生长特征如表1所示，结果表明在30～100 dpb期间，随许氏平鲉体长、肌纤维数目、直径及横截面积随着生长天数的显著增加，体长由(1.10±0.13) cm 增至(5.33±0.25) cm(n=10)，肌纤维数目由(229.83±6.73)个增至(527.18±13.40)个(n=10)，而肌纤维总面积也由(11 657±748.39) μm2增至(334 013.99±2 098.31) μm2(n=10)。通过组织切片观察及数据统计，结果显示(见图3)，在30～100 dpb期间，许氏平鲉背侧第二肌节内肌纤维相对增加面积、肥大面积以及增生面积在相对增加面积中所占的比例在不同时期表现不同。30～70 dpb期间，肌纤维增生生长的相对贡献率较低，70～90 dpb期间，肌纤维相对增加数目逐渐增多，增生面积在相对增加面积中所占比例逐渐上升，在90 dpb时增生生长贡献率为(36±1.27)%(n=10)(见图4)。总之，各阶段许氏平鲉的肌纤维肥大面积在相对增加面积中所占比例均高于增生面积。因此许氏平鲉早期肌肉生长发育主要依赖肌纤维的肥大生长。

图4 许氏平鲉不同日龄肌纤维肥大生长与增生生长贡献比例

图3 许氏平鲉不同日龄肌肉发育变化趋势

表1 不同日龄许氏平鲉生长性状及肌纤维形态的统计分析

2.2 许氏平鲉成鱼肌肉生长规律分析

2.2.1 不同年龄许氏平鲉肌纤维形态学观察及统计分析 为了掌握许氏平鲉成鱼的肌肉生长发育规律，我们制备了1、2、3、4龄的白肌组织切片并进行观察和统计分析，结果如图5所示，可以看出，许氏平鲉的肌纤维直径和横截面积随年龄推移而逐渐增大，且肌纤维之间的空隙也逐渐增宽。如图(见图5 A′～B′)所示，1龄及性成熟后的2龄的许氏平鲉白肌中存在明显的“马赛克”增生现象，而在 3、4龄的许氏平鲉白肌中肌纤维增生现象不明显(见图5 C′～D′)。对不同年龄许氏平鲉肌纤维直径统计结果显示(见图5)，许氏平鲉白肌中新生纤维(直径小于20 μm)所占比例随着年龄增大而逐渐降低，在1龄许氏平鲉白肌中新生纤维所占比例为80%左右，其余部分为直径20～50 μm的肌纤维；在2龄的许氏平鲉白肌中，直径为20～50 μm的肌纤维占比最多，而新生纤维与直径大于50 μm的肌纤维所占比例相当；在3龄的许氏平鲉白肌中，同样是直径为20～50 μm的肌纤维占比最多，但直径大于50 μm的肌纤维占比明显增多；而在4龄的许氏平鲉白肌中，直径大于50 μm的肌纤维占比最多，但肌肉中依然存在新生的肌纤维。

(A～D分别为1～4龄许氏平鲉的耳石示意图；A′～D′分别为1～4龄许氏平鲉白肌横切示意图。标尺为100 μm。A～D represents the otolith of the black rockfish from 1 to 4 years old，respectively. A′～D′ represents cross section of white muscle of the black rockfish from 1 to 4 years old; Black star indicates the mosaic area. Scale bar=100 μm.)

3 讨论

3.1 许氏平鲉幼鱼肌肉生长发育规律研究

鱼类肌肉生长发育不同于哺乳动物仅存在肌纤维增大的肌肉生长方式，而是既可以通过“马赛克”增生的方式增加肌纤维的数量，又可以通过增加肌纤维的尺寸大小达到肌肉肥大生长的目的[8,25]。因此，分析肌肉生长过程中肌纤维的数目、直径及面积大小的变化成为探究鱼类肌肉生长发育的重要方法[30]。鱼类肌肉生长发育过程中肌肉的生长速率存在种间差异，本文通过对许氏平鲉幼鱼阶段肌肉生长发育的研究发现，30～100 dpb期间，许氏平鲉的体长、肌纤维的数目、直径及横截面积随着日龄的增加而显著增大，且在各发育阶段的肥大面积与增生面积所占比重不同，肥大生长的相对贡献率明显高于增生生长，因此许氏平鲉幼鱼肌肉发育阶段的主要动力是肌纤维肥大，但同时存在肌纤维数目的增加。在研究黑鲈(Micropterussalmoides)白肌的发育过程中发现，整个发育阶段都可以观察到肌纤维增生的现象，但新生纤维的比例在不断降低，说明在黑鲈幼鱼成长为成鱼的过程中，还是以肌纤维的肥大为主[25]。而鳜鱼(Sinipercachuatsi)肌肉生长发育的过程中，随着日龄的增加，肌纤维增生与肥大对肌肉生长的相对贡献率存在较大差异。在1～9 dpb肥大面积占比快速增加，而增生面积大幅度下降；随后9～15 dpb期间，增生生长呈现上升趋势，肥大生长逐渐下降；而在15～41 dpb阶段，肌纤维的肥大面积比例再次快速上升，增生面积比例逐渐降低后趋于平稳，由此可见，鳜鱼发育后期骨骼肌生长的主要方式为肌纤维肥大[31]。

3.2 许氏平鲉成鱼肌肉发育规律研究

脊椎动物骨骼肌生长发育过程中，如果存在大量直径<20 μm 的肌纤维，代表肌纤维数目增加的生长方式较活跃[9,30]，如果缺乏直径<20 μm的肌纤维，则代表肌肉对肌纤维的募集能力消失，肌纤维数目不再增加[32]。多项研究证明，大体型硬骨鱼的肌肉生长呈现兼有肌纤维数目增加和肌纤维肥大的无限生长模式[30]。比如牙鲆、褐鳟(Salmontrutta)等，其生长速度较快，肌肉生长的动力包括肌纤维的肥大与肌纤维增生[12-13]。而许多体型较小的鱼类，比如斑马鱼，胚后肌肉生长仅来源于肌纤维的肥大[5, 33]。本研究通过对不同年龄许氏平鲉白肌的组织学观察，初步探究了成鱼肌肉的生长规律。研究发现，在1龄的许氏平鲉白肌中，新生肌纤维所占比例最大，表明在1龄到性成熟的生长阶段，许氏平鲉肌纤维募集能力最强。随着年龄的增加，新生肌肉纤维所占比例逐渐下降，然而在4龄的许氏平鲉白肌中，我们同样也观察到存在直径小于20 μm的肌纤维。据此，我们推测许氏平鲉肌肉呈现无限生长模式，且不同年龄许氏平鲉的肌肉都具备募集肌纤维的能力，但这种能力会随生长而逐渐减弱。

综上所述，本研究对许氏平鲉幼鱼及成鱼的肌肉生长特征及规律进行了初步探究。研究结果发现，许氏平鲉肌肉的生长来源于肌纤维数目的增加及肌纤维肥大，且在早期肌肉发育过程中肌纤维肥大占主要优势。新增生而来的肌纤维存在于各个年龄的许氏平鲉中，包括性成熟以后的个体，这为许氏平鲉肌肉呈现无限生长提供了证据，为后续研究其肌肉无限生长的分子调控提供了基础。