入侵性南美番茄潜叶蛾高效药剂筛选及其抗性基因突变检测

王少丽 史彩华 徐丹丹 张友军

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

南美番茄潜叶蛾〔Tuta absoluta（Meyrick）〕属鳞翅目麦蛾科，又称番茄麦蛾、番茄夜蛾、番茄食心虫等，英文名称为tomato leaf miner 或the South American tomato moth。该虫源自南美洲的秘鲁，2017 年首次在我国新疆伊犁被发现（张桂芬 等，2019），2018 年在云南临沧被发现（张桂芬 等，2020）。南美番茄潜叶蛾作为番茄上的重大害虫，可为害番茄苗期到成株期的任何生长阶段，主要为害叶片，其次是茎与果实。幼虫孵化后钻入番茄叶片组织取食叶肉，初期在叶片上形成小的潜道，随着虫体长大，食量增加，潜道逐渐变大，甚至在叶片上形成不规则的透明斑，叶片被害部位可见黑色排泄物，影响植物光合作用，导致叶片皱缩、干枯、脱落；幼虫还可蛀食番茄果实，形成明显的孔洞，导致果实畸形或在孔洞处感染病菌后腐烂，从而失去商品价值，危害严重时可造成番茄减产80%～100%（Campos et al.，2017；张桂芬 等，2020）。除了番茄，南美番茄潜叶蛾还可为害茄子、辣椒、菜豆和菠菜等作物。由于其个体微小，成虫体长不足1.0 cm，初孵幼虫仅0.4～0.6 mm，易于随种苗、果实、运输工具、装货箱等进行隐蔽的远距离传播和扩散。随着国际贸易的日益频繁，该虫的传播入侵和扩散为害将进一步加剧（冼晓青 等，2019）。

化学防控是南美番茄潜叶蛾综合治理的重要方式之一（Desneux et al.，2011），例如施用氯虫酰胺类和氟虫酰胺类、茚虫威等药剂（Gontijo et al.，2013），但是药剂的持续施用导致不同地域的南美番茄潜叶蛾种群产生了不同程度的抗药性（Biondi et al.，2017）。智利、巴西、阿根廷等国家相继报道南美番茄潜叶蛾对拟除虫菊酯、阿维菌素、杀螟丹、苄氯菊酯、多杀菌素等药剂产生了不同程度的抗药性，其中与菊酯类杀虫剂的抗性相关基因中存在不同的点突变（Haddi et al.，2012；Silva et al.，2015，2016）。在欧洲，南美番茄潜叶蛾对酰胺类杀虫剂茚虫威产生了高抗性，其鱼尼丁受体（ryanodine receptor，RyR）存在不同的点突变，其中G4903 位点的突变可能与该抗性形成密切相关（Roditakis et al.，2017）。在巴西，南美番茄潜叶蛾对多杀菌素和乙基多杀菌素产生了高水平抗药性，其烟碱型乙酰胆碱受体α6 亚基存在G275E点突变（Silva et al.，2016）。上述研究表明靶标抗性基因的点突变在南美番茄潜叶蛾抗性形成过程中起着重要作用。

施用化学药剂是快速控制南美番茄潜叶蛾田间为害的有效手段。为筛选高效防控南美番茄潜叶蛾的化学药剂，本试验评价了7 种不同杀虫剂对为害我国新疆伊宁县番茄的南美番茄潜叶蛾的致死效果，并检测了与菊酯类杀虫剂抗性相关的钠离子通道击倒抗性（knock-down resistance，kdr）基因的点突变，以期为该虫的化学防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

南美番茄潜叶蛾试虫于2018 年8 月采自新疆伊犁伊宁县的露地番茄植株上，在田间直接采集带虫叶片进行杀虫剂的生物测定。同时，收集部分幼虫保存于70%酒精中，用于后续抗性基因克隆及其突变频率检测。

1.2 供试药剂及试验浓度

由于我国目前尚未有防控该虫的指导药剂和推荐剂量，本试验选用的药剂和浓度参考了国际上南美番茄潜叶蛾的防控药剂及十字花科蔬菜上小菜蛾的推荐用量（源自中国农药信息网）并稍作调整。

供试7 种杀虫剂均为制剂：5%氯虫苯甲酰胺悬浮剂〔SC，40～55 mL·（667 m2）-1，深圳诺普信农化股份有限公司产品〕，6%乙基多杀菌素悬浮剂〔SC，20～40 mL·（667 m2）-1，美国陶氏益农公司产品〕，1.8%阿维菌素水乳剂〔EW，30～40 mL·（667 m2）-1，广西田园生化股份有限公司产品〕，5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水分散粒剂〔甲维盐WG，4～5 g·（667 m2）-1，河北中保绿农作物科技有限公司产品〕，4.5%高效氯氰菊酯乳油〔EC，33～50 mL·（667 m2）-1，保定农药厂产品〕，24%溴虫腈悬浮剂〔SC，25～35 mL·（667 m2）-1，山东潍坊润丰化工股份有限公司产品〕，苏云金芽孢杆菌Bt（8 000 IU·μL-1）可分散油悬浮剂（OD，1 200～1 500 mL·hm-2，武汉科诺生物科技股份有限公司产品）。

1.3 药剂筛选方法

南美番茄潜叶蛾为入侵性害虫，为了降低其种群进一步传播扩散的风险，在鳞翅目害虫生物测定常用的叶碟浸渍法基础上，发展了适合潜入叶片取食为害的害虫生物测定方法——带虫叶片浸渍法，即采集带有2～3 龄幼虫的叶片在不同药液中浸渍20 s 后取出，测定不同药剂处理下幼虫死亡率。具体操作：田间采集带有南美番茄潜叶蛾2～3 龄幼虫的番茄叶片，将带虫叶片在不同药液中浸渍20 s，待叶片表面药液自然晾干后，将叶片铺在垫有湿润滤纸的培养皿（直径15 cm）中，每皿放置幼虫15～20 头，盖上皿盖，放入培养箱中，48 h 后检查和记录各处理死亡率。用毛笔尖轻触虫体（对于叶片表皮内的试虫，先轻轻撕开叶表皮后再轻触虫体），不动者记为死亡。设置清水处理作为空白对照，每个处理4 次重复，计算各处理组的校正死亡率。

1.4 kdr 基因克隆及序列检测

利用基因组DNA提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取南美番茄潜叶蛾基因组DNA。扩增引物参考Haddi等（2012）的方法。选择kdr基因的两个序列片段设计特异性引物。其中一段序列长359bp，包含M918T和T929I两个突变位点，上游引物为TAF2（5′-GGCCGACGTTTAATTTACTC-3′），下游引物为TARouter（5′-TGTTTCAACAGAATGACGATACTA-3′）；另一段序列长281bp，包含L1014F 突变位点，上游引物为TAF3（5′-AGAATGGATTGAGAGTATGTGG-3′），下游引物为TAR1（5′-GGTGTCGTTATCGGCAGTA G-3′）。PCR扩增体系为20μL：2×EsTaq MasterMix 10 μL，DNA 1 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，最后用ddH2O 补充至20 μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸2 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认条带大小符合预期后，送交擎科（北京）新业生物技术有限公司测序，在NCBI中进行序列比对分析。

1.5 数据分析

南美番茄潜叶蛾死亡率数据采用DPS 3.0 软件进行数据统计分析，采用Duncan 新复极差法进行差异显著性分析。kdr基因突变频率计算方法：基因点突变频率=〔（抗性纯合子个体数/检测总数）+（抗性杂合子个体数/检测总数/2）〕× 100%。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对南美番茄潜叶蛾幼虫的致死效果

采用带虫叶片浸渍法测定南美番茄潜叶蛾幼虫对7种药剂的敏感性。药剂处理48 h后的结果表明：不同药剂处理后幼虫虫体呈现不同状态。其中，5%氯虫苯甲酰胺处理后，多数幼虫虫体缩短且不取食；8 000 IU·μL-1Bt和4.5%高效氯氰菊酯处理后，幼虫钻出潜藏的叶片表皮；1.8%阿维菌素和6%乙基多杀菌素处理后，幼虫仍然藏匿于叶片表皮；其余药剂处理后试虫无明显上述表现。

1.8%阿维菌素EW、24%溴虫腈SC 和5%氯虫苯甲酰胺SC 处理后，试虫死亡率达100%，显著高于其他药剂处理，表现出对南美番茄潜叶蛾的极高毒力活性；其次为5%甲维盐WG 和6%乙基多杀霉素SC，试虫死亡率分别为92.22% 和91.25%，毒力活性均显著高于8 000 IU·μL-1苏云金芽孢杆菌（Bt）OD；而4.5%高效氯氰菊酯EC对试虫毒力活性极低，未见试虫死亡（表1）。

表1 不同药剂处理下南美番茄潜叶蛾幼虫的死亡率

2.2 南美番茄潜叶蛾kdr 基因序列检测

对南美番茄潜叶蛾菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr基因的PCR 扩增产物进行测序后发现，同时包含M918T 和T929I 两个突变位点的扩增片段长359 bp，包含L1014F 突变位点的扩增片段长281 bp（图1）。将两个片段的测定结果在NCBI 中进行序列比对，鉴定为钠离子通道基因，即为预期扩增基因片段。

图1 南美番茄潜叶蛾kdr 基因片段扩增

随机选取20 头南美番茄潜叶蛾幼虫并提取其基因组DNA，分别检测M918T、T929I 和L1014F 3 个位点的突变频率。结果表明，这3 个基因点突变同时存在，其中M918T 位点检测出12 个抗性杂合个体和8 个敏感纯合个体，基因突变频率为30%；T929I 位点检测出10 个抗性纯合个体和10个抗性杂合个体，基因突变频率高达75%；L1014F位点检测出的20 个样本均为抗性纯合个体，基因突变频率为100%（表2）。

表2 南美番茄潜叶蛾kdr 基因突变频率检测结果

3 结论与讨论

本试验采用带虫叶片浸渍法评价 7 种药剂对南美番茄潜叶蛾的致死效果，结果表明，参照小菜蛾的防控剂量，1.8%阿维菌素EW、24%溴虫腈SC、5%氯虫苯甲酰胺SC、5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐WG 和6%乙基多杀霉素SC 对入侵我国新疆的南美番茄潜叶蛾田间种群具有较高的毒力活性。因此，上述药剂可以参照防控小菜蛾的推荐剂量用于南美番茄潜叶蛾田间幼虫的化学防控。高效氯氰菊酯对南美番茄潜叶蛾幼虫的毒力活性较低，带虫叶片在该药剂中浸渍处理48 h 后，虫口无死亡现象，表明该药剂已不适合用于防控南美番茄潜叶蛾。本试验采用分子生物学手段进行检测，结果发现菊酯类杀虫剂抗性相关的钠离子通道kdr基因存在3 个明显的点突变，其中L1014F 位点的突变频率为100%，T929I 位点75%，M918T 位点30%，表明kdr基因较高频率的点突变可能是高效氯氰菊酯对入侵我国新疆的南美番茄潜叶蛾毒力活性极低的重要原因。根据以往研究，在巴西等12 个国家的南美番茄潜叶蛾田间种群中均发现L1014F、M918T 和T929I 的点突变，且突变频率较高，例如L1014F 为98%，M918T 为35%，T929I 为60%（Haddi et al.，2012；Silva et al.，2015），这与入侵我国新疆地区的南美番茄潜叶蛾种群kdr基因点突变频率基本处于一致水平，由此推测入侵我国新疆的南美番茄潜叶蛾种群的kdr基因点突变是在该虫入侵我国新疆前已经发生并存在，基于可能存在交互抗性，其他菊酯类杀虫剂单剂也不建议用于该虫的化学防控。