SETDB1在炎症性肠病患者肠黏膜组织中的表达及临床意义

王慧玲 赵静 李刚

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD），主要包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）及溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC），是一种消化道的非特异性炎性病变，该病好发于15～30 岁的青壮年，病情迁延反复、难以治愈，致残率高［1-2］，严重影响了患者的生活质量，给患者家庭乃至社会带来极大的经济负担，已成为当今国际消化学界的研究热点和难点之一［3］。本研究前期研究显示：肠黏膜屏障功能障碍可能是IBD 发病机制中的重要因素之一［4-5］。最近有研究发现组蛋白甲基化转移酶1（SET domain bifurcated1，SETDBl）的缺失与肠道上皮细胞分化，屏障破坏，炎症和死亡有关，SETDB1 的缺失会导致内源性逆转录病毒沉默，DNA 损伤和肠上皮细胞死亡［6］。另有动物实验证明，肠道干细胞中SETDB1 的丢失解除了对内源性逆转录病毒的抑制作用，不可逆转地破坏了上皮屏障的稳态，SETDB1 降低的小鼠可引起自发性终末回肠炎和结肠炎［7］。上述研究共同表明：SETDB1 可能在肠道上皮稳态中起着至关重要的作用。但SETDB1 在IBD 患者中的具体表达及其与IBD 患者疾病活动度的关系，目前尚未见报道。本研究通过检测SETDBl 的mRNA 及蛋白在IBD 患者肠黏膜组织中的表达情况，分析其与IBD患者疾病活动度的相关性，为IBD 的诊疗及IBD发病机制的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 IBD 患者标本的收集

收集河南省人民医院2016年9月至2020年9月期间收治的门诊及住院病例，分UC 组、CD 组和对照组（各50 例），并收集患者的相关炎症指标。从IBD 病变活动部位取材，以健康体检者的肠镜活检组织或单纯结肠腺瘤患者肉眼和组织学表现均正常的结肠区域标本为对照，非炎症部位肠黏膜（对照和IBD 患者）和炎症部位肠黏膜（IBD 患者）各取4 块组织；分别用于RNA，蛋白质提取及石蜡包块。本研究参与的患者均知情同意并签署知情同意书，本实验已通过院伦理委员会的审批。CD 和UC 的诊断参考之前的标准。CD 和UC疾病活动度分别以CD 活动指数CDAI 评分及UC活动指数Mayo 评分作为参考［8］。纳入标准：①炎性肠病的诊断标准参考《炎性肠病诊断与治疗的共识意见（2012年广州）》中的标准［9］；②经肠道镜检查、病理学活检证实；排除标准：①恶性肿瘤；②肠道梗阻、穿孔；③严重出血、凝血功能障碍；④自身免疫性疾病；⑤其他肠道疾病。

1.2 主要试剂及仪器

RNA 提取试剂盒（DP440，天根生化，北京）；SETDB1 抗体（CST，美国），qRT-PCR 仪（ABI7500，美国）。 SETDB1 及内参引物均由上海生工生物公司合成；SETDB1上游引物：5′-TCCTGTGAAGCCTGAAGGAC-3′，下游引物：5′-TTAGTTGATGGCAGGCACAC-3′；内 参GAPDH 上游引物：5′-AAAATCAAGTGGGGCGATGC-3′，下游引物：5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

1.3 Q-PCR 检测

按照试剂盒说明书提取总的RNA，并检测其浓度和纯度，RNA 纯度A260/A280在1.8～2.1 之间视为合格。逆转录条件：50℃，30 min；94℃，2 min；循环次数1；RT-PCR 反应：94℃，15 s；60℃，30 s；68℃，3 min；循环次数40。每个样本重复3 个副孔。采用2-ΔΔCt法 计算SETDBI 的相对表达量。DAB 显色；苏木素复染，梯度酒精脱水；二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。Image-Pro Plus 6 软件分析每张照片中肠上皮细胞SETDBl 的平均光密度值，取5 张照片的平均值作为该病例肠上皮细胞中SETDB1 的平均光密度值。

1.4 Western Blotting

提取组织总蛋白和蛋白浓度的测定。按照BCA 蛋白测定试剂盒说明进行浓度检测，分装后保存于-80℃冰箱备用。按照所测蛋白浓度，计算含20 μg 蛋白的体积即为上样量，100℃加热3～5 min 后，煮完后即可上样；80 V 等压电泳30 min 后转为120 V 继续电泳1～2 h 至溴酚兰到达分离胶的底部；电泳结束后，小心取出胶放入电转缓冲液中平衡20 min；TBST 洗3 次×5 min；加入二抗（1∶1 000 缓冲封闭液稀释），摇床上室温振荡孵育1.5 h；TBST 洗3 次×5 min；化学发光、显影。结果分析：胶片用EPSON 扫描仪扫描，FluorchemTM 8900 图像分析软件定量分析靶蛋白及内参照GAPDH 条带的含量，求其比值进行统计分析。

1.6 统计学分析

SPSS 16.0 软件进行统计学分析；计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验；用非参数相关的Spearman 秩相关系数（r）评估两个变量之间的相关性；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SETDB1 的mRNA 及蛋白的表达结果

SETDB1的mRNA 在CD 及UC 患者肠黏膜组织标本中的相对表达量分别为：（2.54±1.33）、（2.88±1.25），均低于正常对照组（3.74±1.88），差异有统计学意义（P＜0.05）；SETDB1 的蛋白在CD 及UC 患者肠黏膜组织标本中的相对表达量分别为：（0.37±0.03）、（0.37±0.05），均低于正常对照组（0.69±0.08），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 SETDB1 的免疫组化表达结果

SETDBI 在CD 及UC 患者肠黏膜组织标本中的相对表达量的IOD 评分分别为：（18±5.1）×103、（37.7±12.5）×103，均明显低于正常对照组（85.8±11.2）×103，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 SETDB1 的表达与IBD 患者疾病活动度的相关性分析

CD 及UC 患者肠黏膜组织中SETDB1 的表达与其疾病活动度评估指标CDAI 及Mayo 评分具有一定的相关性。见图3。

3 讨论

IBD 是一种肠道慢性炎症性疾病，其发病机制尚不清楚。多数研究认为，其发病原因与肠道自身免疫系统、感染因素、环境因素、遗传因素等均有一定的相关性［10-11］。其中，免疫失衡及肠道黏膜屏障功能障碍是IBD 发病的核心环节。因此，维持机体的免疫平衡［12］及肠道黏膜的屏障功能完整［13］是IBD 治疗的关键所在。流行病学研究显示：IBD 的发病率在西方国家逐渐趋于稳定，但是在发展中国家仍呈逐年增高的趋势［14］，已成为消化专业研究的热点和难点之一［15］。因此，进一步阐明研究IBD 发病相关机制，是一项十分重要且亟待解决的任务，具有重要的临床价值及意义。

SETDB1，也称为ESET 或KMT1E，是一种含有SET 结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HMT），属于Suvar3-9 家族，可以通过三甲基化H3K9 调控基因的转录过程。SETDBl 蛋白早期发现是Huntington 病治疗的靶点［16］。近年来的研究发现，SETDBl 蛋白的异常表达与多种肿瘤的发生发展存在着十分密切的关系。胰腺导管腺癌中，SETDB1 通过调节p53 的表达来抑制细胞凋亡［17］；SETDB1 可通过驱动结直肠癌细胞从G0/G1 期进入S 期从而促进癌细胞的增殖［18］；在非小细胞癌中，超氧化物歧化酶1（SOD1）通过miR-409-3p/SOD1/SETDB1 表观遗传调控前馈环促进癌细胞的增殖和转移［19］。SETDB1 在IBD 发病中的作用目前研究较少，仅有个别研究显示：小鼠肠道上皮细胞SETDB1 的缺失与肠道上皮细胞分化，屏障破坏，炎症和死亡有关，SETDB1 在维持肠上皮屏障稳态中可能发挥着重要作用［6］。

本研究提示SETDB1 可能在IBD 的发病中扮演着重要角色，为IBD 发病机制的相关研究提供了新的方向和靶点。但SETDB1 在IBD 发病中的具体作用机制尚需进一步的研究。中山大学附属郭建平教授团队研究发现SETDB1 介导的AKT 的甲基化与PI3K 介导的AKT 的磷酸化相互作用，SETDB1 与PI3K协同调控AKT的活化［20］。mTORC1 是PI3K/AKT 信号通路下游的主要靶基因，且mTOR 抑制剂他克莫司在UC 诱导缓解和维持治疗方面均具有显著的治疗效果［21］。上述研究提示，SETDB1 可能通过PI3K/AKT-mTOR 通路在IBD 的发生发展中发挥着重要作用，但具体作用机制仍需进一步探究。