食源性沙门氏菌检测方法的研究进展

凌玲

（南丹县疾病预防控制中心，广西 南丹，547200）

自2007年-2008年的食物事件中，是世界比较关注的话题。诱发这些事件的元凶是极为罕见的致病菌，是比较常见的病原菌-沙门氏菌。沙门氏菌是对人与动物健康构成危害较大的致病菌，也是人类食物中常见病原菌[1]。但当前，我国对诸多对沙门氏菌检验通常取传统培养方式，报告检验数据需一周，耗费时间较长，程序繁琐。因此，创建准确的测定方式是沙门氏菌检验的中心问题。当前，主要用传统标准测定方式等来检测。

1 沙门氏菌

1.1 沙门氏菌感染因素 沙门氏菌是自然界的宿主，部分能够对宿主进行选择，很多对人、动物均能够适应，会寄存于哺乳类等人胃肠道中，特别是在家养、野生动物中感染率较高。所以，各包装、运输等在加工与处理期间均可能会污染。如：宰杀家禽时卫生条件不到位，肠腔沙门氏菌会对肉类造成污染，并于肉类中储藏[2]。市场出售、厨房加工期间经各用具互相污染，零售市场所购的生肉受沙门菌污染的最高达58%。蛋类、蛋制品污染来源，可是禽类卵巢，还可因粪便中沙门氏菌绕过蛋壳步入蛋内。通常诸多因蛋混合所制的蛋粉中，感染率较高。乳类与制品如冰淇淋等食物均会遭受沙门氏菌感染，这些动物源性食物均是造成沙门氏菌感染的重要介质。原料以动物脏器为主的生物制剂，如：酶、胆盐等均会引发感染，发展中国家水源经常会受到污染，污水灌溉等为散发最主要原因[3]。人与人直接传播是按护士手、医疗器械为媒介，这也是医院中感染暴发流行的主要因素。

1.2 沙门氏菌生物学性质 沙门氏菌于百余年前发现，对人与动物的健康均会造成危害，菌属类型繁杂，抗原复杂。自从分离出食源性沙门氏菌依赖，可从人、动物中分离较多菌群、血清型、变种，最普遍的是肠炎沙门氏菌[4]。沙门氏菌对外界环境的抵抗力较强，能够在肉类等食物中存活数月。

1.3 沙门氏菌危害 沙门氏菌为世界范围内众所公认的食源性致病菌，食物传播为人类感染沙门氏菌的主要路径，蛋类、肉类等食物均和沙门氏菌存在一定关系[5]。人类沙门氏菌特点为恶心等症。潜伏期处于8h-72h，患者进食受污染的食物后会于36h后病发，症状大约为一周。

2 检测方法

2.1 传统标准测定方法 传统测定沙门氏菌的方法是分步增菌对食物样品进行测定，加大病原检出情况。培养方式可于总体各阶段开展。①预增菌，选择培养基，确保其高营养，取样品加入其中，温度37℃，促使细菌复苏，确保全部微生物的生长[5]。②选择性增菌步骤，沙门氏菌生长会使其存在的微生物数量变少，和预增菌培养接近，筛取选择性培养基时，有多项观点。当前的类型可分成三类，分别是：连四硫基盐肉汤、硒酸盐胱氨酸肉汤、RV培养基。由于无任何培养基确保全部食品基质。因此，科学的做法即是用不同培养基平行地开展试验。③分离环节，选择性培养物于含多种遏制非沙门氏菌生长制剂琼脂平板划线培养，确认平板上肉眼可探寻的特征性菌落，对菌落分离物加强血清学测定，并予以鉴定。

虽然这种方法是当前有效的方法，但因切割等诸多因素，食物中沙门氏菌具有间歇性且密度低，因此有必要重复分离较大样品于增菌肉汤中的培养。既往沙门氏菌测定期间至少一周方可确定[6]。整个检验程度极为繁杂，消耗大量人力。从实验人员入手，所选的单菌落、手工生化测定等各步骤凭借操作者主观判断，由于要求测定检测经验丰富，检验数据是否准确一定程度凭借检测者专业素质与实验阶段工作变化。这种方式不够客观，方便，节约时间，速度快捷。

2.2 聚合酶链反应技术（PCR） 常规PCR：有人员按自己设计的引物，获取增产物为沙门氏菌基因的DNA片段。研究对已知被沙门氏菌污染样品均可扩增出特异亮带。测定未知污染情况，发现2个样品受沙门氏菌污染，表示PCR方式于样品测定中，数据可靠[7]。在样品DNA含量上，梯度稀释时，需对各稀释度样品PCR扩增，DNA含量为0.01pg时，会扩展出条带，表示PCR扩增对沙门氏菌的测定中灵敏度高。PCR方式对样品的测定中，所得各数据清晰，对样品无过高要求，检测时间过短，所花费用高，操作复杂，操作残留的污染容易致使假阴性、假阳性，需专用仪器设备，实际检验缺乏操作性[8]。建立在PCR基础上对沙门氏菌的测定上，部分人员会将其与其他基因结合测定沙门氏菌。经多重PCR能够将检出率提高，有效对血清型进行鉴别，检测时间可下降。但用多重PER需区分引物退火温度，内在或扩增物能够阻碍PER，并对其展开分析。RT-PCR（Real—Time PER）：有人员按肠炎沙门氏菌特异性序列作为模板，对引物进行设计，实验全部污染样品经RT-PCR测定，数据呈阳性[9]。沙门氏菌实时定量PCR测定技术保留常规PER测定敏感性，全部过程由电脑干预，由加样数据仅需2h[10]。能够同步对多个样品扩增并定量，能够对多样品进行测定处理，将测定效率提高，对食物污染做好监测，准确判断食物中毒事件，还可对样品中细菌污染程度展开定量分析，灵敏度比传统PCR高，自动化简单，会发展为测定细菌的主要方式。

2.3 免疫学方法 酶联免疫吸附：酶联免疫吸附测定法（ELISA），其原理是将抗原、抗体提前结合于固相载体表面，添加受检样品、酶标抗原，使其于载体上抗隐患、抗体发生反应，成为抗原复合物。通过洗涤量反应液中剩余物质取出，添加反应底物后，底物固相载体上酶催化变为有色产物，最后经定性有色产物确定样品中待测物质含量。国外最早发现测定鼠伤寒沙门氏菌ELISA方式[11]。这种方式离心细菌后，转移至醋酸纤维薄膜上，并于多孔板中固定，添加抗鼠伤寒沙门氏菌鞭毛抗体效用，加入第二酶标抗体作尉，最终颜色为底物色，产棕色、兰色呈阳性。这种方式最小检出量至104-105CFU/ml，不足之处是会诱发假阳性反应。免疫荧光标记：免疫荧光细胞化学是结合抗原抗体反应理念，将已知抗原或抗体标记上荧光素制为荧光标记物，用荧光抗体充当分子探针检查细胞对应抗原。细胞、组织中产生的抗原抗体复合物上存在荧光素，用荧光显微镜对标本进行观察，荧光素激发光照射会出现明亮荧光，能够清晰观察荧光所处细胞，找寻抗原，并对其定位，用定量技术测定含量。

国外学者还尝试用自动荧光抗体检测系统对食品沙门氏菌进行测定，每小时能够鉴定120个玻片样品[12]。和常规研究相比，准确率较高。研究人员用荧光抗体测定系统测定食品中沙门氏菌。系统能够同时对14个样品进行测定，所得数据可靠，操作容易。还有学者用表面吸附法将测定样品吸附在玻璃表面的薄膜上，用免疫荧光显微镜判定数据[13]。这种方法测定限为103-5/ml个沙门氏菌，不会出现假阴性、假阳性反应。

2.4 SPR生物传感器测定 从SPR技术在化学传感器领域研究以来，SPR传感器逐渐变为传感器领域特点，其研究甚晚，处于起步环节。我国当前尚未将SPR传感器在食品中沙门氏菌测定。结合SPR生物传感器实时测定灵敏度特征将其在沙门氏菌测定中应用。全部测定期间于1h内展开，迅速测定[14]。但因测定细菌浓度过高，需逐渐将传感器测定权限放大。

3 结语和展望

沙门氏菌是人、畜共患的病原菌，会诱发人类沙门菌病。创建科学的食源性沙门氏菌定量测定，不仅检测速度可加快且更为准确，及时处理受污染的食品，对公共卫生均意义显著。

沙门氏菌测定方式较多，包含传统细菌培养、PCR等。既往细菌培养程序繁多，至少需一周方能得出定论，难以适应迅速简捷的要求。常规PCR方式虽然迅速且便捷，但容易受到污染，假阳性高。与之比较，RT-PCR能够攻克PCR不足，操作便捷，数据可靠且直观，极为灵敏。渐渐发展成极为重要的测定方式，虽然SPR生物传感器可迅速对其测定，但SPR传感器价格过高，研究会花费较高费用，对检测干扰较大，但其于这项领域中对病菌方面前景尚可，需进一步探索。

综上所述，沙门氏菌是食品卫生测定的重要目标菌，测定方式意义深远。不仅门氏菌测定灵敏度高，检测时间也可缩短，检测程度可简化，检测会向自动化迈进，可重复性高，简单、易行，经济价值高。