貉细小病毒性肠炎研究进展

郭晓芹，赵传芳※，胡博，吕爽，白雪，张蕾，张海玲，吕甜甜，曹海旭，于小亚

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.吉林省科技创新平台管理中心，吉林 长春 130012）

目前，对貉子的研究，国内集中于预防检疫（流感病毒的预防检疫[1]、圆环病毒的检测[2]、新孢子虫和弓形虫血清阳性率的筛选[3,4]）与遗传机制（如染色体对比的亲缘关系比较[5]、微卫星标记的鉴定发展[6]、基因的克隆鉴定[7]、基因多态性的比较[8]和线粒体基因组的拼接[9]）等方面。而国外（如欧洲）的貉子大抵都是从东亚地区引进，作为主要的毛皮动物，偏重研究貉群体结构和遗传特性，而对育种方面的研究较少，所以我们可以在这方面多加关注，使我国占领貉子养殖的领先地位[10]。貉细小病毒性肠炎是一种急性、高度接触性传染病，幼貉患病后死亡率达90%以上[11]，给貉的养殖造成巨大的经济损失。据调查发现，貉细小病毒肠炎近年来在我国的发病率呈上升趋势。2013-2018年间，在齐鲁动物保健品有限公司所检测的毛皮动物肠炎病例中有91.4%是貉细小病毒肠炎[12]。

1 病原学

1.1 生物学特性

貉细小病毒（RDPV）是肉食动物细小病毒的一种，能够自我复制，在其5.3 kb的单链DNA基因组中有两个转录单位，基因组的两端存在有利于DNA复制的回文发夹结构[13]。基因组中右侧单位产生结构蛋白VP1和VP2，并形成26 nm二十面体衣壳[14]，非结构蛋白NS1和NS2从基因组左侧转录单位表达。其中VP2是细小病毒的主要衣壳蛋白（约90%），决定病毒的抗原特性、宿主范围、血凝性及介导病毒粒子对宿主细胞感染的能力[15]。多项研究表明，VP2蛋白第300位氨基酸是调控宿主范围的重要位点。一项研究中将猫细小病毒（FPV）的VP2蛋白300处从Asp突变为His后会使FPV变得更易于与猫TfR受体结合[15]；而在一项针对浣熊细小病毒（RPV）的研究中发现将VP2蛋白300处由Asp（GAT）转变为Gly(GGT)/Val(GTT)后，RPV就可以感染犬细胞（正常RPV是不会感染犬的）且通过体外实验证明VP2蛋白300位氨基酸的改变可使犬、猫、雪貂和貂的细胞均受到感染[16,17]。值得注意的是，病毒入侵宿主机体是一个极为复杂的过程，因此，细小病毒中VP2蛋白的300位氨基酸调控宿主范围还需进一步的动物试验来证实其准确性[18]。NS1是一种核磷酸蛋白，主要参与RDPV的复制、转录以及病毒对宿主的致病性[19,20]。

1.2 理化特性

RDPV能够凝集不同哺乳动物（如恒河猴、猪及马等）和鸟类的红细胞且血凝反应可被特异性抗体抑制。在RDPV血凝实验中缓冲液的pH值对其血凝效价影响不大[21]。RDPV对外界的抵抗力很强，耐酸和耐热性好，乙醇、氯仿及胰酶等大多数消毒剂都不能使其灭活。病毒粒子可被福尔马林、次氯酸钠、-丙内酯、羟胺、氧化剂和紫外线照射灭活[22]。

1.3 RDPV的遗传与进化

RDPV与 细小病毒（CPV）、FPV、水貂肠炎病毒（MEV）、RPV和蓝狐细小病毒（BFPV）都源于一个共同祖先。1900年FPV首先被发现，随后出现FEV、MEV等，1978年CPV以CPV-2型首次在犬体中被发现。之后随着VP2蛋白变异不断涌现出CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b等新基因型，其中CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c既可感染犬又可感染猫[23,24]。根据相关文献得知，RDPV自1984年（首次在我国黑龙江省发生）至今所分离出的毒株虽然都属于CPV-2亚型，但从2016年开始，RDPV主要衣壳蛋白VP2上的多个氨基酸残基发生了非同义性突变，包括S27T、S297A和I418T，这被称为新型CPV-2，可能是细小病毒进化的过渡阶段[25-27]。

2 流行病学

每年的6～10月份，该病主要是患病貉或者耐病貉的粪、尿和唾液经过消化道和呼吸道传染给免疫前后的幼貉（7～9周龄），幼貉的发病率大于70%，死亡率高达90%，成年貉发病率和死亡率均在20%左右，多呈慢性和隐性感染，成为最危险的传染源[21]。

3 临床症状及病理变化

本病的潜伏期为5 d左右，病程一般为4～14 d，15 d后多转为亚急性或慢性经过。患病貉出现精神萎靡、被毛凌乱无光泽、腹泻（腹泻粪便上附有黏液，呈灰白色管柱状物，严重的会出现番茄样血便）、体温升高且白细胞明显急剧减少等症状[28]，在病死貉的胃肠道内均有出血现象。肠黏膜（尤其是十二指肠）有坏死和纤维素性伪膜，肠系膜淋巴结细胞减少，网状细胞增多，肠绒毛断裂，肠道固有层炎性细胞浸润。肠系膜淋巴结和脾脏肿大、充血，脾脏可见淋巴细胞减少[29]。

4 致病机理

细小病毒基因组不能编码DNA聚合酶，所以仅能在分裂细胞的细胞核复制，这决定了其对感染靶点的选择即那些大量存在有丝分裂细胞的组织和器官，如新生组织、淋巴系统和肠上皮细胞等。细小病毒感染是系统性感染包括各种组织和器官系统，细小病毒经消化道或者呼吸道首先在感染动物的咽上皮（扁桃体、淋巴结）上复制，之后进入血液循环产生病毒血症，进而传播到淋巴器官和骨髓上造成淋巴细胞和骨髓增殖细胞的坏死，导致淋巴细胞减少，从而出现泛白细胞减少症。在这之后病毒复制增殖到高度分裂的肠隐窝细胞，导致肠腺的上皮细胞死亡使上皮脱落、绒毛变短，最终表现出本病的典型临床症状——呕吐和腹泻[30]。但是，胎儿或新生动物感染疾病特征有所不同，FPV感染幼猫可以导致共济失调并发症，病毒感染小脑，导致小脑的发育不全[31]。

5 检测技术

5.1 病原学、血清学检测

如果具备新鲜猪血，选择血凝试验（HA）和血凝抑制（HI）实验可在几小时内得到结果；假如检测的时间足够，可以选择常规的病原学的病毒分离鉴定和血清中和试验（SN），只要具备相应的条件，这些病原学及血清学的检测方法依旧不失为经典。

5.2 分子生物学检测

随着生物技术的不断发展，细小病毒的分子生物学检测方法相应增多。目前，应用比较成熟的技术包括常规PCR法（扩增特异DNA片段）、间接免疫荧光和酶联免疫吸附实验（ELISA）等，这几种检测技术操作简便，高效灵敏，相对来说比较常用。

实时荧光定量PCR（qPCR）技术灵敏性高，稳定性强，对于检测20～30份样品，qPCR所用的时间仅是传统PCR所用时间的1/2[32]。实时PCR可根据基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，再建立标准曲线，可用于定量检测病毒，还有研究人员采用qPCR测定了CPV的抗原型，成功地将qPCR应用于病毒的分型鉴定上[33]。

核酸探针检测技术：利用荧光生物素标记核酸，通过荧光观察检测病原，具有较高的灵敏性和准确性。值得一提的是，有研究人员利用小沟结合（MGB）探针测定法成功地区别检测了CPV-2型疫苗和CPV野外毒株，给接种CPV疫苗后患病犬的检测带来了福音[34]。

LAMP是一种体外等温扩增特异核酸片段技术，目前在多个细小病毒属鹅细小病毒（GPV）、CPV、老鼠细小病毒（MPV）、牛细小病毒（BPV）和FPV等中都得到了应用[35]。根据已建立起的这些方法来看，LAMP最大的优点在于能够简单地进行现场检测，有研究建立的检测CPV的LAMP方法，制备简单的模板后可以直接在疑似患病犬的粪便样品中检测CPV，方便快捷[36]。而根据建立的检测GPV的LAMP方法，反应条件只是需要65℃的水浴，20 min后就能得到结果[37]。

重组酶聚合酶扩增（RPA）：通过与侧流层析试纸条、生物芯片及凝胶电泳等多种方法相结合的方式进行检测的核酸恒温扩增技术。已经有针对犬细小病毒2型（CPV-2）建立的RPA技术检测方法，反应只需在水浴中进行，和LAMP检测方法一样，可用于现场或者野外条件下的CPV检测[38]。

6 疫苗防控

现在我国仍利用CPV-2和MEV-B型疫苗对貉细小病毒性肠炎进行防控。随着对细小病毒研究的不断深入，针对其制备的疫苗也越来越多。目前主要包括3类，即传统疫苗、基因工程苗和病毒样颗粒疫苗。

传统疫苗包括灭活苗和弱毒苗。灭活疫苗（Inactivated Vaccine）主要诱导体液免疫，虽然安全，但诱导动物产生的抗体水平持续时间短，免疫原性不理想，多次免疫效果显著。弱毒疫苗（Attenuated Vaccine）有良好的免疫原性，是目前使用频率最高的。但是弱毒疫苗能致使毒力返祖，而且对于变异毒株的保护率较低，所以在研制弱毒疫苗时，应该广泛开展细小病毒病的流行病学调查，筛选疫苗保护率高的候选株，同时加强对疫苗临床使用后抗体的监测。

基因工程疫苗包括重组活载体疫苗、基因疫苗和亚单位疫苗等。重组活载体疫苗（Recombinant Live Vector Vaccine）是利用基因工程技术将抗原基因重组到其他无致病性的病毒或细菌的基因组内，使动物机体产生免疫反应。该疫苗能刺激动物机体产生B细胞、T细胞免疫以及黏膜免疫。活载体疫苗是新型疫苗的代表，表现在其免疫效果好、经济和可操作性强，并且可以构建联苗，便于大规模制备[39]。基因疫苗（Gene Vaccine）又称DNA疫苗，细小病毒的基因疫苗是利用基因工程技术将VP2或VP1蛋白抗原基因克隆到真核表达载体，注入动物体内，使外源基因在动物体内表达，产生B细胞免疫和T细胞免疫。根据相关研究表明，利用VP1、VP2构建的真核表达质粒可成功诱导动物机体产生免疫反应，保护动物免受病毒的攻击。但是外源基因在体内长期存在可能会产生遗传毒性或者整合到宿主染色体从而引起突变[40]。针对问题所在，自杀性DNA疫苗应运而生，不仅可产生较强的免疫应答，而且能使插入的外源基因凋亡，不会引起机体DNA的改变[41]。亚单位疫苗（Subunit Vaccine）是将病毒的保护性抗原基因与真核或原核表达载体进行重组表达，然后将重组的重组蛋白处理后添加一定量的佐剂制备而成。目前对于亚单位疫苗的研究处于基础水平，主要是由于技术不够成熟，免疫后抗体水平不理想。由于亚单位疫苗不含有病毒的核酸，因此安全性很高，未来有很大的研究价值。

病毒样颗粒（VLPs）疫苗是利用病毒的一个或多个结构蛋白组装成空心颗粒，它虽在形态上与病毒相似，但由于其是不含病毒的核酸，因此不能进行自我复制，所以安全性比较好。肉食动物细小病毒VLPs的制备一般是利用病毒结构蛋白VP2进行真核或者原核表达后组装获得。据目前报道，在昆虫细胞[42-44]、大肠杆菌[45]、毕赤酵母[46]以及马克斯克鲁维酵母中[47]表达的VP2蛋白都能够自组装成VLPs，且制备的疫苗具有较高的免疫原性。罗国良等[48]将貉细小病毒基因RDPVVP2-OPTI与昆虫表达载体pFastBac1连接然后转化到杆状病毒DH10 Bac E.coli中经培养获得表达貉细小病毒RDPV-VP2蛋白的重组杆状病毒，然后转染SF21细胞，培养至细胞出现感染后收集细胞病毒液制备疫苗，实验证明此疫苗对貉细小病毒有良好的免疫效果和预防效果。对于目前来说，肉食动物细小病毒VLPs的获得率比较低，所以开发出一种高效的表达体系，提高其获得率从而将病毒样颗粒疫苗推向临床应用是未来VLPs疫苗的新走向[49]。

7 展望

貉子养殖在我国已经有40年之久，虽然养殖技术越来越成熟，养殖环境得以改善，但是由于细小病毒的不断变异，给貉病毒性肠炎的防控增加了新难题。未来对于貉细小病毒的防控需要我们进行流行病学调查，及时了解RDPV的进化、变异和发展趋势，这样才能针对变异毒株，制备更加有效的疫苗。另外，2020年新冠病毒（SARS-CoV-2）暴发，在养殖水貂中快速传播并使其发生变异，变异后的毒株被证实能同时感染水貂和人[50]。而同样作为毛皮兽的貉子是否能被SARSCoV-2感染也应有相应流行病学调查进行跟踪，为人类和动物创造一个安全的生活环境。