乳腺癌分子诊断常见方法及意义

胡慧 韦伟

分子诊断是指应用分子生物学方法，检测病人体内遗传物质的结构或表达水平变化而做出诊断的技术。它将实验室医学与分子遗传学的知识和技术有效结合起来，主要分为基因测序、基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)等技术。

一直以来，对于乳腺癌的治疗决策均基于解剖学基础的肿瘤分期，以及生物学特征为基础的分子分型。随着高通量基因检测技术的进步，和以个体化医疗为基础的“精准医疗”概念提出，乳腺癌治疗策略已经由最大可耐受的治疗转变为最小不良反应的有效治疗。

美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC) 在第8版乳腺癌分期中增加了对多基因检测的推荐，美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO) 也分别在2007年和2017年先后批准Oncotype DX(21基因) 和MammaPrint(70基因) 用于指导早期浸润性乳腺癌辅助治疗决策。乳腺癌多基因检测已成为学界关注的热点之一。本文就当前国内外应用最广泛、可及性最高的乳腺癌分子诊断检测方法及意义作一综述。

目前检测早期乳腺癌多基因表达谱方法主要有Oncotype DX(21基因)、MammaPrint(70 gene)、EndoPredict(12个基因)和50个基因的Prosigna,以及国内基因公司开发的72基因等。以美国为例，每年有约40%以上乳腺癌病例会使用基于肿瘤组织基因表达的分子诊断，医生和病人依据诊断结果决定手术后是否进行化疗、预测辅助化疗获益，甚至新辅助化疗效果和远处转移风险；35%以上病例会基于分子诊断结果而改变治疗方案。

一、21基因(Oncotype Dx)

1.21基因检测：21基因检测由美国国家外科辅助乳腺癌和大肠癌研究计划(NSABP)与Genomic Health公司(GHI)开发。主要针对激素受体阳性和淋巴结阴性的早期乳腺癌病人，预测其内分泌治疗效果及远处转移风险。该技术是采用高通量、实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，检测石蜡包埋的乳腺癌组织中16个与癌症相关基因和5个内参基因，共21个基因[1-2]。包括增殖相关基因(Ki-67、CyclinB1、STK15、Survivin、MYBL2)，激素受体表达相关基因(ER、PR、 Bel2、SCUBE2)，通路激活(HER-2，GRB7)，细胞侵袭相关基因(Stromelysin3、CathepsinL2)和其他基因(GSTM1、BAG1、CD68)，以及用于标准化目标检测基因表达水平的内参基因(ACTB、GAPDH、GUS、RPLPO和TFRC)[3]。之后又在此基础上，依据21个基因表达程度，建立了分值0～100的复发风险评分标准(recurrence score，RS)和计算公式，再结合NSABP B-20试验入组病人，研究RS评分与10年复发风险之间关系，建立了最初的RS评分等级。其可将乳腺癌分为低复发风险组(RS<18)、中复发风险组(RS=18～31)和高度复发风险组(RS≥31)三个阈值范围。

2.21基因检测的预测价值：NSABPB14试验首次验证了21基因检测的预后价值。在低、中、高风险人群中，10年远处复发率分别为6.8%、14.3%和30.5%[1]。2006年4月，美国国家癌症研究所资助了第一个前瞻性研究，TAILORx(Trial Assigning Individualized Options for Treatment)临床试验，研究结果于2015年发表[4]。结果表明，应用21基因检测RS为0～10的病人只接受内分泌治疗，5年无病生存率(disease-free survival，DFS)为93.8%，5年无复发生存率(recurrence-free survival，RFS)为99.3%，5年总生存率(overall-survival rate，OS)为98.0%。表明HR阳性、HER-2阴性的cT1-2N0期的乳腺癌病人，如果RS<11，仅接受内分泌治疗的5年远处复发风险<1%，可免除不必要的化疗。2019年TAILORx研究在新英格兰杂志上发布了二次分析的结果，研究显示对于RS评分为11～25分的HR+/HER2-，单纯内分泌治疗的疗效并不劣于化疗联合内分泌治疗；但从年龄分层来看，50岁或以下，RS评分16～25分的患者，化疗能带来一定的获益。2021年NCCN指南在对21gene的推荐中也提出对于复发评分16～25岁、年龄≤50岁的患者，除内分泌治疗外应该给予化疗。

2016年4月《新英格兰医学杂志》发表了法国贝格尼研究所、瑞典卡罗林斯卡医学院、美国蒙特菲尓医学中心，关于乳腺癌21基因表达检测法国际多中心大样本前瞻性验证结果，显示根据21基因检测的结果，高达70%的ER阳性、淋巴结阴性的病人手术后可以免除化疗[5]。

21基因在新辅助化疗也进行了相关研究。ASCO2020的一项研究显示，穿刺活检的复发评分结果可以预测乳腺癌对新辅助化疗的反应，21基因有助于预测早期乳腺癌病人选择新辅助化疗是否受益。复发评分≥25分的病人获得0-1型组织学反应的可能性要高5倍[6]。2020年SABCS公布的ADAPT研究也显示，21基因RS评分能预测新辅助化疗疗效，RS>25分亚组比RS≤25分的亚组pCR率显著升高(16.1% vs 7.2%)[7]。

3.21基因复发评分临床加强版：2020年12月，美国《临床肿瘤学杂志》在线发表了美国爱因斯坦医学院、匹兹堡大学、哈佛大学达纳法伯癌症研究院、以色列拉宾医疗中心、特拉维夫大学的联合研究结果[8]。该研究通过对TAILORx和NSABP B-14研究中的10 004例激素受体阳性、HER2阴性、淋巴结阴性乳腺癌病人进行荟萃分析，结合21基因复发评分和临床病理因素(肿瘤分级、肿瘤大小、年龄)，开发出一种新工具：复发风险临床加强版(RSClin)。之后，又根据以色列克拉利特医疗服务登记数据库1 098例病例观察到的远处复发风险，对RSClin推算远处复发风险的准确性进行了验证。结果显示，RSClin与单用复发评分或单用临床病理因素相比，其对远处复发的预测准确率显著较高(P<0.001)，并且与观察到的10年远处复发风险非常接近(林氏一致性指数高达0.962)。对于肿瘤分级Ⅱ级、肿瘤1.5 cm的55岁乳腺癌，如果RSClin复发评分范围为11～50，那么化疗绝对获益率仅为0～15%，可选择避免化疗。

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

RSClin结合了临床病理和基因组风险，在指导淋巴结阴性乳腺癌术后辅助化疗方面，与单用临床病理数据或单用基因组数据相比，其能够提供更具个体化的疗效和预后信息。

二、70基因(MammaPrint)

1.70基因概述：70基因是荷兰癌症研究院与Agendia公司联合开发的一种乳腺癌多基因检测系统，其采用双色cDNA芯片技术测定包含与调控细胞周期、增殖、血管新生、侵袭、转移、信号转导等癌症生物学特征相关的70个基因的表达情况。是在病人接受手术之后，作出其他治疗决定之前，对乳腺癌新鲜或石蜡包埋的组织进行检测。早在2007年MammaPrint便已获美国FDA批准上市，成为第一个经批准的体外诊断多基因检测产品。CSCO乳腺癌诊疗指南也在2019年将70基因检测正式纳入乳腺癌术后辅助治疗的评估推荐，用于指导1～3个淋巴结阳性早期乳腺癌病人治疗决策[9-10]。

与21基因方法类似，70基因根据基因表达水平对病人进行评分，并限于ER阳性和淋巴结阴性乳腺癌病人，以及部分淋巴结阳性但不愿接受术后全身辅助化疗病人的治疗决策。但70基因只分低和高复发风险组，以减少中间组造成的不确定性。目前MammPrint(玛普润)已经在中国市场经官方授权正版引进。

2.70基因与MINDACT研究：作为一种预后工具，70基因检测具有良好的预后预测价值，可将淋巴结阴性或1～3枚阳性的病人分为预后好组与预后差组，其对于乳腺癌病人复发风险的分类精确度达98.5%，技术重复性达98.9%[11]。

为了前瞻性验证70基因的准确性，研究者开展了名为MINDACT的临床试验，以判定临床指标与基因指标的优劣。MINDACT研究入组了来自欧洲112个肿瘤中心的6 693例早期乳腺癌病人，以70基因检测确定基因风险，以Adjuvant! Online v8.0临床病理系统来确定临床风险。若基因检测与临床病理系统均提示低风险，病人不予化疗，仅接受内分泌治疗；若两种检测都判断为高风险，则予术后化疗；当基因评估和临床评估不一致时，随机分为接受或不接受化疗组。

2016年《新英格兰医学杂志》报道该研究达到首要终点目标，即在临床高危(C-High)/基因低危(G-Low)组不化疗的病人中，5年无远处转移生存率(DMFS)为94.7%，而化疗组较不化疗组的5年DMFS获益增加只有约1.5%；而对于C-Low/G-High组，化疗带来的DMFS获益更小。从总体上看，在全部临床高风险病人中，若采用70基因检测指导化疗，将减少46.2%的化疗率[4]。

2020年ASCO大会又更新了MINDACT中位随访8.7年的数据，基本维持了2016年结论。更新数据后，C-High/G-Low组5年和8年DMFS分别为95.1%和90.8%，G-Low不化疗组较G-High化疗组预后更佳；对于C-High/G-Low病人，化疗与不化疗相比，5年DMFS差异是0.9%，8年DMFS差异仅增加2.6%，依然没有统计学意义，也就是说C-High/G-Low组病人可以考虑豁免化疗。但对于绝经前(年龄<50岁)的C-High/G-Low病人，DMFS仍有5%化疗获益。因此，这部分病人在权衡获益与毒副作用的基础上，可以选择化疗[12]。

另一项新辅助化疗前瞻性研究显示，经过新辅助化疗的ER+/HER2-乳腺癌，MammaPrint70基因低危亚组pCR率仅为2%，而高危亚组pCR率可达到13%，而且新辅助化疗的pCR率与MammaPrint分数呈线性相关[13]。

三、50基因(PAM50)

50基因由美国北卡罗来纳大学教堂山分校与Prosigna公司共同研发，其通过检测肿瘤组织中与乳腺癌相关的50个基因的表达量来对乳腺癌进行分型，并用于预测肿瘤小于5 cm、激素受体阳性、HER2阴性，且最多有3个淋巴结转移的绝经后早期乳腺癌，在接受激素治疗5年后，10年内出现远处复发的风险[14]。

2013年9月美国FDA批准其用于乳腺癌预后预测的体外诊断,目前PAM50已被欧盟、澳大利亚等国家和地区批准用于乳腺癌分型及预后预测。如果PAM50评分高，则表明乳腺癌转移风险高，除内分泌治疗外还建议病人化疗；如果PAM50评分低，则仅予病人内分泌治疗即足够。因此，PAM50能帮助一部分病人免除化疗及其带来的副作用[15]。此外，目前PAM50 还在进行是否能帮助识别哪些ER阳性乳腺癌病人，可以从超出5年的内分泌治疗中获益的相关研究[16]。

与21基因相比，50基因增加了分子分型，能依据分型指导不同亚型的辅助治疗。但不足之处在于其没有将那些和乳腺癌预后密切相关的肿瘤组织免疫基因的表达，纳入风险评估体系，因而对转移危险评估尚待提高。

四、EndoPredict测试(12基因)

EndoPredict测试是Myriad公司推出的一项将肿瘤分子生物学状态与临床因素(肿瘤大小和淋巴结状态)相结合的第二代多基因检测方法，可分析乳腺癌细胞中12个基因的活性，这些基因都与癌症10年内远处复发的风险相关[17]。

EndoPredict主要针对那些初诊为ER阳性、HER2阴性、淋巴结阴性或者不超过3个淋巴结转移的早期乳腺癌病人的基因组测试，使用的是手术或者活检过程中切除的组织，可用于判断肿瘤在10年之内远处转移复发的风险，进一步区分低复发和高复发风险人群，帮助医生在内分泌治疗基础上，针对性地选择是否联合化疗或者延长内分泌治疗，以进一步减少治疗不足和过度治疗。

测试采用EPclin风险评分，该评分在1.1到6.2之间，对应于复发风险的百分比：EPclin风险评分高于3.328 7(高于10%的复发风险)为高复发风险；风险评分低于3.328 7(低于10%的复发风险)为低复发风险。

五、72基因

2018年10月，由复旦大学附属肿瘤医院和美国北卡罗来纳大学Lineberger癌症研究中心牵头，联合国内多家机构共同完成了一项肿瘤内免疫基因表达对乳腺癌远处转移风险影响的研究，首次将免疫相关基因表达引入乳腺癌预后及远处转移风险评估。该研究通过对5000余例乳腺癌全基因表达谱及临床数据分析，筛选出17个与预后密切相关的免疫基因，这些基因对ER阴性、增殖基因高表达的乳腺癌病人发生远处转移风险有显著影响。有进一步结合以往研究结果，建立了72基因乳腺癌远处转移风险预测模型PrecitypeDx[18]。

乳腺癌72基因检测是基于亚洲人群浸润性乳腺癌设计优化的多基因检测工具，其通过二代测序(NGS)方法，对乳腺癌肿瘤组织中72个基因(免疫相关基因、增殖相关基因、基底细胞相关基因、ER相关基因、HER2相关基因、侵袭相关基因和参考基因)的表达进行检测。根据各基因的表达谱特征，对乳腺癌进行亚型分型，得到五种分子亚型：(1)管腔A型(Luminal A) ；(2)管腔B型(Luminal B) ；(3)HER2富集型(HER2-enriched) ；(4)基底细胞型(Basal-like) ；(5)免疫增强型(Immune-enhanced)。并可以对其治疗给出不同建议。

另外72基因可结合增殖指数(proliferation score)和免疫指数(immune score)来计算风险，将最终的检测结果量化为一个0到100之间的数字，以得到一个复发风险评分(PRS)，进而预测5年和10年内远处复发风险。72基因有望为临床治疗方案的选择提供更有用的支持信息。

六、不足之处及展望

2017年版的《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范》提出，乳腺癌术后辅助全身治疗的选择，应基于复发风险个体化评估与肿瘤病理分子分型及对不同治疗方案的反应性。多基因检测的目的在于帮助乳癌病人避免过度治疗或治疗不足。但在国内目前还没有自主研发的成熟多基因产品，现有的多基因检测技术在研发过程中缺乏中国病人的随访数据，检测结果用于指导中国病人的临床治疗存在一定的不确定性。

有报道称通过对6个多基因检测工具进行两两比较后，一致性仅有36%～74%。另有研究提示，不同检测工具之间的一致性差，如30%在70基因检测中评价为高风险人群，却被21基因检测评价为低风险[19]。此外，基因检测只能预测特定人群的复发风险与化疗获益，无法制定个体化的化疗方案，也无法预测高危病人辅助化疗后的残存风险。而国内检测费用高昂，检测机构不规范，也限制了分子诊断在临床上的推广和应用。

分子诊断检测技术本身是精准医学的体现，利于制定个体化的治疗方案。尽快纠正国内现有检测混乱现象，可让病人尽早享受到该技术带来的获益。但在目前循证医学证据下，分子诊断只能作为传统临床病理因素的补充和有限应用于特定病人。未来依靠高通量平台建立多组学特征谱、多学科交叉预测模型及多节点动态监测复发风险，应成为乳腺癌多基因检测的发展方向。