超声波联用技术绿色养护中药材当归的可行性

李芳蓉，刘玲玲，牛娟，张建军，赵云峰，韩秀凤

(甘肃中医药大学 药学教学部，甘肃 定西 743000)

0 引言

甘肃省是我国中药材生产大省，定西市誉为“千年药乡”，盛产各种中药材，中药材为地区经济发展和民众生活水平的提高做出了重要贡献.市辖岷县为“中国当归之乡”.当归是本市主要道地中药材，誉为“岷归”，种植历史悠久，品质优良，全市所产当归产量占全省的 90%和全国的70%[1]，岷县成为国际和国内当归药材的主产区和供应区[2].据初步调查，道地药材当归、党参等贮藏养护的技术和方法欠科学，霉烂虫蛀问题十分严重，影响药材质量，经济损失巨大，直接降低药材的安全有效性.随着生活水平提高和保健意识增强，药食同源药材当归的生产规模不断扩大和市场需求量逐年递增，受市场等因素的影响也越来越大，库存量也随之加大，贮藏期间发生霉变、泛油、变色、变茬和受仓贮害虫的危害也日益严重[3].据调查，当归是甘肃省受仓储害虫危害最严重的中药材之一[1].

1 当归绿色科学养护的重要性和迫切性

当归为伞形科植物当归[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的干燥根[4].其味甘、辛、微苦，性温，归肝、心、脾经[5-6].有补血活血、调经止痛、润燥通便之功效，常见于多种类型的遣药组方中，其药用价值趋向于多样化[7]，是常用大宗药材之一.始载于《神农本草经》，属无毒上品药，素有“十方九归”之美誉[8].临床用含当归药物多达80余种，亦可作为滋补品食用.

因当归中含有较多的多糖类成分，贮藏过程中经常会被虫蛀，发霉，泛油，散发异味等.导致药材腐烂变质，降低临床用药的安全性和有效性，造成巨大的浪费和经济损失；同时，当归富含的挥发油类成分，在长时间贮藏中逐渐减少.目前对于当归的贮藏养护，大多仍沿用传统的硫磺熏蒸阴干法，防止当归发霉和虫蛀，减少贮藏期有效成分的消耗[9].虽然硫熏防霉防虫蛀效果好，硫磺熏蒸会在一定程度上影响药物疗效且对人体造成伤害[10].尤其若过度使用会造成其化学成分和药理作用的改变及残留超标[11-12]，因而研究当归的科学绿色贮存及防霉防虫养护成为亟待解决的问题.

2 超声波及其联用技术

2.1 超声波技术

超声波频率高、波长短、方向性好、穿透力强，具有特殊的物理性能，安全性高，无化学残留，使用便捷.超声波技术在工农业、医疗卫生、生物技术、食品工业和环境保护等方面发挥着重要作用[13-14].超声清洗主要利用超声空化效应对物体表面污物撞击剥离.超声波对微生物具有杀灭作用的原因是空化效应能够扰乱微生物细胞生命活动，也使得细菌对杀菌剂更为敏感[15].超声清洗中药材快速彻底，不留死角，且空化效应能在细胞液与细胞壁间产生微射流及局部高热高压，抑制虫卵，强烈杀灭细菌、霉菌、病菌等[16]，能实现节水环保，快速洗涤，有效保护中草药，同时，经超声清洗中药材干燥时间明显缩短[17-18].超声波清洗中药材省时省力，清洁度高，中药材有效成分损失量少[19]，是理想的中药材清洗方法[20-21].将当归药材在贮藏保存前预先进行超声波清洗，提前消除隐患，有利于后期的贮藏养护，是科学绿色当归养护的技术.

2.2 天然抑菌防腐性环境友好高分子

天然抑菌防腐性环境友好高分子在果蔬保鲜中的应用较多.壳聚糖具有良好的抑菌活性、环保性、成膜性、通透性、生物降解性、生物相容性及抗菌谱广等特点，是一种潜力巨大的新型天然防腐剂.壳聚糖与高分子和离子性复合物可形成凝胶，成膜，广泛应用于食品保藏和水果保鲜[22].水溶性壳聚糖在酸性介质中具有更好的抑菌性能[23].壳聚糖可以在贮藏期内有效对中药材防霉防蛀[24].魔芋葡甘聚糖是一种可再生的天然高分子多糖，溶于水后能形成高黏度的假塑性溶液，具有黏性、稳定性、成膜性、凝胶性、抗菌性及可食性等优点，被广泛应用于医药、食品、化工、农业等领域，可作为膜液原料广泛应用于农产品的贮藏保鲜[25]，在可食用膜的制作方面应用前景广阔[26-27].甘露聚糖是一种既经济又高效的天然食品防腐剂，其无色、无毒、无异味能有效地防止食品腐败变质发霉和遭受虫害，可用于水果、蔬菜、豆制品、蛋类以及鱼类等食品的保鲜贮藏[28-29].将当归贮藏前预先超声清洗，再利用超声波的分散作用，在当归药材表面均匀的涂布一层天然抑菌性环境友好高分子，使当归药材与外界环境隔离，阻断贮藏期霉菌、细菌和病毒的侵蚀，具有安全、高效、无化学污染的特点，是绿色科学的当归药材贮藏养护技术.

2.3 紫外线杀菌消毒技术

紫外线(UV-C)处理是无化学污染的物理处理法，一方面，UV-C可诱导其相关酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等产生，提高果蔬抗病性，减少采摘后的腐烂及其产生的经济损失；另一方面，使用紫外线消毒，可减少各种化学保鲜剂的使用，属于绿色环保的贮藏保鲜途径[30-31].同时，空气中的O2在紫外线照射下可产生一定量具有更强氧化性的O3，进一步增强其抑菌消毒效果.紫外线消毒机理是利用其较强的化学效应，以容易穿透生物细胞壁的200～280 nmUV-C照射待消毒物品，破坏生物机体细胞中的DNA或RNA分子结构，使细胞死亡，从而达到杀菌消毒效果.将当归药材贮藏前预先超声清洗，再用UV-C照射，即利用超声-UV联用技术养护当归，是科学绿色的贮藏养护技术.

2.4 O3灭菌消毒技术

O3具有强氧化性，是一种安全、环保、高效、无残留的新兴灭菌剂，目前已被广泛应用于医疗卫生、生产生活等各领域.研究表明O3具有明显灭菌、杀虫效果和一定的除异味作用，对储粮和环境无污染[32].但O3浓度与灭菌杀虫效果的关系、O3浓度的检测等有待进一步研究.将其应用到中药材的贮藏养护中，0.3 mg/L 的O3水能提高药材活性物质的含量，提高幅度与药用植物的器官有关[33-34].O3灭菌过程机理为生物化学过程，能氧化分解细菌内部所必须的葡萄糖氧化酶，直接破坏细菌病毒的细胞器和核糖核酸，分解DNA、RNA、蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，破坏细菌的物质产生、代谢及繁殖.能渗透胞膜组织，侵入细胞膜内作用于外膜脂蛋白和内部脂多糖，使细胞通透畸变，溶解死亡[35]，并且将死亡菌体内遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、枝原体及热原(细菌病毒代谢产物、内毒素)等溶解变性灭亡[36].O3灭菌属于溶菌，能彻底、永久地消灭物体表面所有微生物.将当归药材贮藏前预先超声清洗后，再进行O3灭菌处理，即利用超声-O3联用养护，是科学绿色的当归药材贮藏养护技术.

3 超声波联用技术养护当归后养护效果的评价

3.1 待检药效成分选定

选择确定了当归的指标性或代表性药效成分，作为超声波联用技术养护当归药材后评价养护效果的待检药效成分.当归的主要有效成分为阿魏酸、当归多糖、藁本内酯、丁烯基苯酞和丁基苯酞[37]等.其中阿魏酸是当归主要水溶性活性成分，常作为当归质量鉴定的标志性化合物，《中国药典》2020年版规定，阿魏酸为当归药材的检测指标.阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓及心脏保护等药理活性[38-39]，能清除自由基和促进清除自由基酶的产生，增强谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，调节人体生理机能，具有抗抑郁和抗老年痴呆作用.藁本内酯是当归中重要活性成分，是公认的鉴定当归真伪和评定其质量的特征指标之一[40].有很强的解痉、平喘、镇静作用，能改善微循环，松弛平滑肌，抑菌，提高机体免疫调节功能，具有抗动脉粥样硬化、神经保护、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、镇痛等广泛的药理活性[41].丁烯基苯酞和丁基苯酞具有扩张血管、改善脑部微循环、抗心肌缺血缺氧和抗抑郁等功效[42]，也是当归的主要药理活性成分.当归多糖是当归主要水溶性成分，具有促进造血、增强免疫功能、抗肿瘤、抗辐射损伤的药理作用和生物活性[43].

3.2 待检药效成分分析测定方法

为了评价养护效果，选择确定了超声波联用技术养护当归后药效成分的分析测定方法.

3.2.1 高效液相色谱法分析测定阿魏酸、藁本内酯、丁烯基苯酞和丁基苯酞

高效液相色谱法(HPLC)，以液体为流动相，采用高压输液泵将具有不同极性的流动相(单一或混合溶剂、缓冲液等)泵入充有固定相(填充剂)的色谱柱，注入供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号，实现试样的分析.该法具有分离效能高、选择性好、分析速度快、载液流速快、检测灵敏度高、自动化程度高、流动相选择范围宽和应用范围广等特点.可分析超过80%的有机物，特别是对高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物分离分析更显优势.同时，不破坏样品，易回收，色谱柱可反复使用.

3.2.1.1 阿魏酸的分析测定.HPLC法测定阿魏酸含量具有应用较广、方法简单、可靠且专属性好的独特优点，一般使用C18柱色谱柱，甲醇和水流动相，冰醋酸pH调节剂.何元等[44]建立了不同产地当归药材HPLC指纹图谱，并测定了药材及其提取物中阿魏酸等2种主成分的含量.建立的HPLC指纹图谱结合含量测定，聚类分析(CA)和主成分分析(PCA)方法可全面客观有效地进行当归药材质量评价，为当归配方颗粒的制备提供参考依据.罗铮等[45]建立当归中阿魏酸等5种活性成分的HPLC测定方法.方法的精密度、重现性和稳定性等方法学考察结果均符合指导原则要求.杨蕊菁等[46]采用HPLC法同时测定当归中的阿魏酸及其他9种成分的含量以评价不同产地样品的质量.结果HPLC法结合主成分分析法可综合评价当归药材的质量，方法准确简便，重现性好，并为当归药材的质量评价提供依据.马纪伟等[47]的研究表明采用HPLC测定养血当归软胶囊中阿魏酸的含量，方法简便，样品处理方便易行，可作为养血当归胶囊的质量控制方法.刘雪枫等[48]采用HPLC法测定当归芍药散不同极性部位中阿魏酸和芍药苷的含量，实验结果表明该方法简便、准确、分离效果好.

3.2.1.2 藁本内酯的分析测定.藁本内酯是当归挥发油主要组分和重要活性和有效成分，也是公认鉴定当归真伪和评定其质量的特征指标[49].藁本内酯易氧化分解而难于保存[50]，进而影响以其为主要有效成分的中药材质量.其测定方法主要有HPLC法、气相色谱法和双波长薄层扫描法，但HPLC法使用更广.王祝举等[51]建立了HPLC法测定当归中藁本内酯含量的方法，方法学考察表明，该法准确、灵敏、简单、快速，可作为当归药材及饮片质量控制的方法之一.赵奎君[52]采用HPLC法和比色法，测定甘肃、云南、四川、陕西等地产当归中阿魏酸、藁本内酯和总多糖的含量.表明甘肃当归其道地性具有科学依据.吴姣等[53]建立了当归胶囊的有效成分藁本内酯和阿魏酸含量的HLPC法测定方法.该方法准确可靠，可用于当归胶囊中有效成分含量测定.凌钢等[54]采用HPLC法测定不同厂家当归流浸膏中阿魏酸和藁本内酯的含量，结果表明不同厂家的当归流浸膏中两种成分的含量差异较大，同一厂家不同批次的当归流浸膏中两种成分含量也存在差异，故需尽快完善当归流浸膏的质量标准.陈方等[55]构建了13批产地不同当归藁本内酯含量的HPLC指纹图谱并进行方法学考察，优化其测定方法并建立了HPLC指纹图谱评价方法，测定方法简便、可靠、稳定、可行.潘娉娉等[56]建立同时测定补肾活血药对杜仲-当归阿魏酸、藁本内酯等5种成分的含量的HPLC法.研究结果表明该方法准确稳定，重复性好，可用于杜仲-当归药对的质量控制.叶晓娅等[57]采用HPLC法同时测定当归片中阿魏酸、藁本内酯等的含量.经方法学考察方法均符合有关规定，可用于当归片的质量控制.马云桐等[58]建立HPLC法同步测定川芎、当归SFE-CO2萃取物中藁本内酯等7种成分含量的方法，并考察其中阿魏酸松柏酯的稳定性.方法精密度、重复性、稳定性、加样回收率均良好，乙腈溶液中萃取物中阿魏酸松柏酯稳定性均最佳.马丹等[59]采用HPLC法测定当归滴丸中藁本内酯的含量，结论该方法准确、简便可行、精密度高、重复性良好，可作为当归滴丸中藁本内酯的定量测定方法.

3.2.1.3 丁烯基苯酞的分析测定.丁烯基苯酞是当归挥发油的另一主要成分，其含量在当归挥发油中仅次于藁本内酯[60]，是当归活血调经的药效成分[61-62].谢京晶等[63]采用HPLC法同时测定当归中丁烯基苯酞等6种成分含量的方法，结果表明方法准确、简便、重复性和稳定性良好，有利于提高当归药材的质量控制.肖宇奇等[64]采用HPLC法对当归样品中的化学成分进行分离分析，分析不同生长期当归中化学成分丁烯基苯酞等的动态变化.杨帆[65]以HPLC-MS/MS联用的方法定性研究当归中主要化学成分，由液相获得了苯酞类化合物的丰富的结构信息，为当归药材的质量控制提供更多科学依据.李冬华等[66]以高效液相色谱法测定当归饮片中阿魏酸、藁本内酯和正丁烯基苯酞的含量，用以建立和完善当归饮片质量标准.

3.2.1.4 丁基苯酞的分析测定.丁基苯酞(3-正丁基苯酞)是当归又一重要的药效成分，其测定主要以HPLC法.王宁宁等[67]以HPLC法研究3-正丁基苯酞在大鼠体内的组织分布情况.丁军霞等[68]建立了HPLC法同时测定当归中正丁基苯酞等5种成分及不确定度评定方法，结果表明不确定度评定可为当归有效成分的定量研究提供一定参考.钟应淮等[69]采用HPLC法同时测定茶芎苯酞类有效部位中正丁基苯酞等5种成分的含有量，结果表明方法稳定可靠，可用于茶芎苯酞类有效部位的质量控制.赵春顺等[70]采用反相高效液相色谱法测定3-正丁基苯酞脂质体的含量及有关物质检查，结果表明方法操作简便、快速、准确、专属性强，适用于3-正丁基苯酞的含量测定及其有关物质检查.崔升淼等[71]以HPLC法测定3-正丁基苯酞的量，研究药物质量浓度和羟丙基-β-环糊精(HPCD)用量对3-正丁基苯酞吸收的影响.余昕等[72]采用HPLC法测定不同干燥方法干燥的蘼芜中丁基苯酞的含量，结果表明蘼芜的干燥方法宜选用晒后烘干法.郭小藤等[73]采用HPLC法同时测定川芎油中藁本内酯、洋川芎内酯A和丁基苯酞含量，结果表明，该法相对方便经济.姚宗玲等[74]建立同时测定川芎中川芎嗪、阿魏酸、丁基苯酞、藁本内酯和丁烯基苯酞5种有效成分含量的RP-HPLC方法.方法简便快捷，重复性好，回收率高，可用于川芎中5种有效成分的同时测定，适用于川芎药材及其制剂的质量控制.赵晓莉等[75]采用HPLC法测定络通胶囊中丁基苯酞的含量.方法简便准确，重复性好，可用于络通胶囊中丁基苯酞的含量测定.

3.2.2 紫外可见光谱法测定当归多糖

紫外可见光谱法(UV-Vis)利用物质分子吸收紫外、可见光光谱区(10～760nm)辐射进行分析测定，涉及原子和分子的价电子能级间的跃迁，广泛用于测定有机和无机物.具有灵敏度、准确度和选择性都较高等特点，操作快速简便.

当归多糖成分复杂，目前含量测定多采用UV-Vis法.张素斌等[76]采用苯酚-硫酸UV-Vis法测定当归多糖含量对4种当归多糖提取方法的比较研究.吴平安等[77]采用苯酚-硫酸UV-Vis法，以无水葡萄糖为对照品，在波长487 nm处测定当归中的多糖含量.刘云[78]醇提当归多糖并以采用苯酚-硫酸UV-Vis法测定当归多糖含量，研究表明，当归多糖含量较高，可进一步开发利用.何先元等[79]以超声提取当归多糖，以苯酚-硫酸UV-Vis法测定其含量，结果是超声提取-分光光度法可以快速准确测定当归多糖含量.许会生[80]探索了当归多糖等的提取工艺，建立了多糖含量测定的苯酚-硫酸UV-Vis法，其研究和测定方法规范可靠.

4 结束语

综上所述，当归临床应用广泛，但因贮藏养护技术方法欠科学，霉烂和虫蛀等各种变质变异现象严重，科学贮藏养护势在必行.超声波洗涤中药材快速，环保，节能，节水，能够抑制虫卵、杀死害虫、强烈杀灭细菌、霉菌、病菌等，药效成分散失少，且有效保护中药材的作用.天然抑菌，防腐性环境友好高分子在果蔬保鲜中的应用广泛，O3灭菌杀虫效果明显，在储粮保鲜中应用广泛.UV-C能提高果蔬抗病性，减少采后腐烂；减少化学保鲜剂的使用，是绿色环保的贮藏保鲜途径.选定超声波联用技术养护当归后评价养护效果的待检药效成分为阿魏酸、藁本内酯、丁烯基苯肽、丁基苯肽和当归多糖，选定各成分测定方法分别为HPLC法测定阿魏酸、藁本内酯、丁烯基苯肽和丁基苯肽，UV-Vis法测定当归多糖.各待检成分代表性强，测定方法得当，操作简便，重现性好，稳定性高，可靠性强，实际应用广泛.将无残毒、无公害、安全绿色的超声技术、超声-O3、超声-UV、超声-O3-UV等技术联用，应用于当归药材贮藏养护中，可以提前消除隐患和并保证贮藏期间的防霉防蛀等变质变异现象，具有广阔的研究和应用前景，必将为中药材的科学养护与管理提供有力的理论支持和实践指导，为中医药的发展，为药材主产区的经济发展做出应有的贡献.