自噬在肾脏缺血再灌注损伤中的研究进展

徐洁，王丽媛，于洋，唐小铁

(1.武汉科技大学医学院，武汉 430080；2.武汉科技大学附属普仁医院肾内科，武汉 430080)

临床上，急性肾损伤具有发病率高、病死率高的特点，给患者和社会带来极大的经济负担，是全球性的严重的医疗保健问题[1]。流行病学研究表明，急性肾损伤是终末期肾脏病的主要危险因素，常发展为慢性肾脏病[2]。肾脏缺血再灌注损伤是指缺血的肾脏在完全或部分恢复血流灌注后出现损伤加重及肾功能恶化(即肾组织细胞缺血缺氧、肾小管细胞损伤)而引起的肾脏损伤[3]。肾脏缺血再灌注损伤常见于心血管手术、创伤、休克和肾移植的患者，是临床上急性肾损伤最常见的病因[4]，其发生机制非常复杂，是引起肾衰竭和影响预后的重要原因，但目前尚缺乏有效的治疗策略[5]。导致肾脏缺血再灌注损伤的机制主要包括能量代谢障碍、钙超载、线粒体损伤、氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡及自噬等[6]。自噬广泛存在于真核生物内，在调节细胞生命活动中具有重要作用[7]。许多疾病的发生、发展均涉及自噬，如感染、肿瘤、代谢性疾病[8]。目前自噬是各领域的研究热点，其中，肾小管上皮细胞的自噬是目前关注的焦点。在急性肾损伤的发生、发展过程中，自噬相关信号通路上的关键部位可能为急性肾损伤的治疗提供新的策略[9]，但自噬在肾脏缺血再灌注损伤中的作用尚存在争议，现就自噬在肾脏缺血再灌注损伤中的研究进展予以综述。

1 自噬的基本概念和发生过程

1.1自噬的基本概念 1962年，Ashford和Porter[10]在研究人肝细胞时，在电子显微镜下观察到了自噬；随后Tsukada和Ohsumi[11]在研究酵母时发现了自噬相关的分子机制；1969年在药物诱导的肾损伤小鼠近曲小管中首次发现了包含受损细胞器的自噬体[12]。随着研究的深入，自噬在急性肾损伤中的研究取得重大进展。自噬通过参与受损细胞器以及蛋白质的清除和再循环实现胞质成分更新，以保持细胞内平衡，并参与细胞生长、生存的调节，是机体进化过程中保守的代谢机制，对组织细胞具有保护作用。自噬时溶酶体水解酶降解细胞内受损的大分子、蛋白质聚集物和功能失调的细胞器，降解后的成分被回收，用于合成细胞生命活动所需的蛋白质、细胞器和能量等[13-14]。在生理条件下，自噬的顺利进行有助于维持细胞内外稳态，进而维持机体稳态[15]，在人体各项生命活动的顺利进行中均发挥重要作用。脓毒血症、肾急性缺血以及药物和重金属诱导的肾毒性是引起急性肾损伤的常见原因，为了应对这些压力，自噬途径被激活[16]。通常情况下发生的自噬对组织细胞具有保护作用，但过强的刺激导致自噬过度也可能加重组织细胞损伤，甚至引起细胞死亡，称为Ⅱ型程序性细胞死亡[17]。

根据细胞内容物运输至溶酶体的方式，哺乳动物内的自噬包括巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬就是通常所说的“自噬”，是主要且广泛研究的降解或消除受损细胞器和蛋白质的自噬途径，底物蛋白被双层膜的结构包裹后形成自噬体，并运输至溶酶体内进行消化水解[18]。微自噬及伴侣介导的自噬研究较少。

1.2自噬的发生过程 自噬的发生过程非常复杂，主要分为3个阶段，即自噬体形成、自噬体与溶酶体融合以及自噬溶酶体降解。自噬体的形成涉及多个自噬相关蛋白(autophagy related protein，Atg)复合体的协同作用，主要包括UNC-51样激酶(uncoordinated 51-like kinase，ULK)1/2复合体、Beclin-1/Ⅲ类磷脂酰肌醇-3激酶复合体、Atg12-Atg5-Atg16 L1复合体以及微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ)的修饰等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)共同参与ULK1/ULK2复合体的调节，以激活自噬[19]；随后，Beclin-1/Ⅲ类磷脂酰肌醇-3激酶复合物启动细胞膜泡成核，同时结合Atg21和Atg24到膜上，形成自噬体的前体装配结构[20]。隔膜的延伸、闭合、形成自噬体涉及2条泛素化途径：Atg12-Atg10中间体形成后促进Atg12和Atg5转移，形成共价连接的Atg12-Atg5与Atg16L1结合形成Atg12-Atg5-Atg16L1复合体[21]；随后，Atg12-Atg5-Atg16L1复合体被招募至吞噬泡膜上，通过与磷脂酰乙醇胺共价结合生成脂化LC3[22]；LC3被Atg4分解为LC3Ⅰ后被E1样酶Atg7激活，转运至Atg3，与磷脂酰乙醇结合成为LC3-磷脂酰乙醇(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ是自噬体外膜和内膜的重要组成部分，而Atg12-Atg5-Atg16L1复合体只存在于自噬体的外膜[23]。

成熟的自噬体和溶酶体结合形成的自噬溶酶体可将其内底物进行降解，自噬生物学功能的顺利进行依赖上述过程的顺利完成。正常情况下，细胞内可观察到少量自噬体，自噬活性提高，观察到的自噬体增多；另外，自噬体与溶酶体结合障碍或者自噬溶酶体降解障碍引起自噬体无法清除，检测到的自噬水平也可增高[24]。

2 自噬在肾缺血再灌注损伤中的双重作用

自噬在肾缺血再灌注损伤的发生、发展过程中起重要作用，许多体内外实验中均观察到在肾缺血再灌注损伤过程中自噬被激活[25-26]，但表达上调的自噬究竟对肾脏起保护作用还是加剧肾脏损伤目前仍存在争议。一方面，自噬可降解异常细胞内异常的蛋白及细胞器，防止有害物质的积累，对细胞的生存起到保护作用；另一方面，过高水平的自噬可损伤细胞器，使其转化为自噬细胞死亡。因此，自噬在肾缺血再灌注损伤中是把双刃剑。

2.1自噬对肾缺血再灌注损伤的保护作用 目前已有超过40种自噬相关基因被发现，为验证自噬在肾缺血再灌注损伤中的作用，特异性剔除自噬相关基因Atg5后，电镜下观察发现，肾小管上皮细胞内存在大量损伤的线粒体、自噬底物p62等，肾脏对缺血性损伤更敏感，肾功能损伤更严重[27]。另外，在自噬相关基因Atg7剔除的小鼠体内也出现了相似的结果[28]，这些实验均证实自噬缺乏可加重肾缺血再灌注损伤后的肾功能恶化。Bian等[29]的研究也表明，肾缺血后自噬不足可加重缺血再灌注损伤。在肾移植诱导的大鼠肾缺血再灌注损伤模型中，高压氧治疗可通过激活自噬减轻炎症损伤，从而发挥保护作用[30]。而在缺血预处理模型中，通过血清和糖皮质激素诱导激酶1/叉头框蛋白O亚族3a/缺氧诱导因子-1α通路可激活自噬流，发挥肾脏保护作用[31]。这些研究均提示肾缺血再灌注损伤诱导的自噬可能在疾病发生、发展过程中起到肾保护作用。但自噬保护肾缺血再灌注损伤的关键调控通路目前尚不清楚。肾缺血再灌注损伤是引起急性肾损伤的主要原因，自噬的激活可为肾组织细胞的存活提供保护机制，并为急性肾损伤的临床治疗提供潜在策略，但关键通路还有待进一步研究。

2.2自噬对肾缺血再灌注损伤的损伤作用 自噬的发生可能加重肾脏损伤，自噬通量异常或自噬长时间激活可能会破坏细胞内稳态，引起细胞死亡[32-33]。Suzuki等[34]的研究提示，自噬在肾缺血再灌注损伤中可以加重肾组织损伤，而抑制自噬可显著减少过氧化氢刺激的肾小管上皮细胞乳酸脱氢酶的产生，发挥肾脏保护作用。大鼠肾缺血再灌注损伤诱导的自噬被抑制后，肾组织细胞色素C和氧自由基的释放显著减少，肾功能显著改善[35]。成纤维细胞生长因子10可通过mTOR途径抑制过度自噬，并抑制由泛素结合蛋白核自噬受体SQSTM1(sequestosome 1)/p62介导的炎症反应，减轻肾缺血再灌注损伤[36]。由此推测，自噬可能在缺血再灌注过程中对肾小管造成损伤。肾缺血再灌注损伤是动态变化的过程，自噬也随之变化，造成上述研究差异的原因部分可能与实验模型中采用的动物、细胞种类不同以及不同研究中缺血再灌注持续时间、观察时间点各不相同有关[37]。因此，未来对肾缺血再灌注损伤中自噬作用及机制的研究应基于对这个变化过程的全面了解，这样有助于更好地理解自噬在肾缺血再灌注损伤中的作用。

3 自噬在肾缺血再灌注损伤中可能的调控机制

3.1AMPK-mTOR通路 AMPK和mTOR是两种营养能量敏感激酶，AMPK受AMP/ATP比值、缺氧、氧化应激等因素调控[38]。在肾缺血再灌注损伤中，AMPK-mTOR表达活跃，mTOR可以抑制自噬的发生，是自噬的负性调控因子，在自噬过程中发挥核心作用，而AMPK可以通过抑制mTOR来增强自噬[39]。在肾缺血再灌注损伤中，AMPK可间接通过抑制mTOR复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的活性增强自噬或者直接通过磷酸化及活化ULK1/2调节自噬[40]。在体外缺血再灌注肾小管细胞损伤模型中，AMPK诱导的自噬对肾脏具有保护作用[41]。同样，在肾小管细胞构建的缺氧/复氧模型中，用吡格列酮预处理可通过AMPK-mTOR信号通路增强自噬作用，从而保护机体免受缺血再灌注损伤[42]。肝再生增强因子也可通过AMPK/mTOR途径负向调节肾缺血再灌注损伤中的自噬，自噬抑制细胞凋亡，并在氧化应激条件下发挥肾脏保护作用[43]。因此，AMPK调节的mTOR途径是肾缺血再灌注损伤过程中诱导自噬的一个重要信号通路。

3.2磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)-mTOR通路 PI3K-Akt-mTOR通路可调控细胞周期、细胞增殖、细胞生长、存活、蛋白质合成以及葡萄糖代谢等[44]。mTOR蛋白在PI3K-Akt信号通路的下游，调控PI3K-Akt可通过mTOR影响自噬的发生、发展。在肾脏近端肾小管HK-2细胞中，蛋白酶激活受体2的过表达可通过激活PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制自噬，并诱导自噬相关炎症反应；同时，通过蛋白酶激活受体2的RNA干扰转染剔除蛋白酶激活受体2可抑制PI3K-Akt-mTOR通路，极大地增加自噬并减轻自噬相关炎症反应[45]。研究证实，雷帕霉素及其衍生物可通过抑制PI3K-Akt-mTOR通路激活自噬[46]。但研究中所涉及的自噬激动剂和抑制剂大多为非特异性，具体对哪一种自噬起作用目前尚不清楚，且这些药物在增强或减弱自噬过程中可能对其他生理过程造成影响。最近的研究认为，mTOR抑制剂雷帕霉素不能预防肾缺血再灌注损伤或顺铂诱导的肾毒性引起的急性肾损伤，因此不可作为自噬相关肾保护机制的理想模拟物[47]。未来需寻找更具特异性的自噬激动剂和抑制剂进行进一步的研究。

3.3氧化应激相关作用机制 正常情况下，生物体维持低水平的氧化应激，而病理状态下氧化还原稳态的失调及中性粒细胞的募集致活性氧类(reactive oxygen species，ROS)和活性氮过度生成，进一步导致氧化应激及相关细胞成分的氧化损伤，而代谢率高的肾近端小管细胞遭受了最严重的氧化应激损伤，导致细胞损伤和凋亡(即引起继发性损伤)，在肾缺血再灌注损伤中抑制氧化应激反应可减轻肾脏损伤[48]。在肾脏疾病的发病机制中，氧化应激与自噬流的激活相关，mTOR是自噬通路的关键信号分子，其活性受PI3K、Akt、AMPK等多条通路调节，当ROS过度产生时，自噬可通过PI3K-Akt-mTOR通路启动[49]；同时，ROS所诱导的自噬也受到AMPK/mTOR通路的调控[50]。研究证实，ROS还可通过影响AMPK-mTORC1-ULK1通路以及Kelch样ECH相关蛋白1/核因子E2相关因子2系统调节自噬[51]。沉默信息调节因子1参与细胞存活、新陈代谢、基因沉默等多种过程，在体内肾缺血再灌注损伤模型中发现，沉默信息调节因子1可通过上调自噬抑制氧化应激，从而降低细胞凋亡，发挥肾脏保护作用[52]。另外，针对氧化应激产生的活性氮与自噬相关的研究较少，有研究表明，活性氮调节的自噬可能加重缺血再灌注损伤[53]。可能是由于机体在遭受缺血再灌注损伤时产生过量的ROS，引起脂质的氧化反应，使细胞内线粒体膜、内质网膜等受到损伤，而引发自噬增强，自噬通过降解受损细胞器及胞内异常的蛋白质等代谢产物维持细胞稳态，调控氧化应激、减轻肾脏损伤，发挥保护作用。

3.4p53途径 肿瘤抑制基因p53在调节细胞凋亡和自噬中发挥重要作用，生理状态下，p53作为四聚体发挥作用，并且低表达于细胞中，当各种原因使机体处于应激状态时，p53转录活性升高，表达显著升高，p53根据其亚细胞定位，对自噬的调控具有双重作用，核p53可激活自噬，而胞质p53可能具有抗自噬功能[54]。研究证实，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating protein two of p53，ASPP2)的下调可以通过激活自噬，改善肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤[55]。p53的转录活性还通过下调人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced kinase 1，PINK1)的转录而抑制自噬，而PINK1编码参与线粒体吞噬的关键蛋白[56]。另外，胞质p53对细胞自噬的抑制作用还可能受到微RNA(microRNA，miRNA/miR)的调控，如miR-125b、miR-214等[57]。由于p53涉及体内多条代谢途径，p53对自噬的作用目前仍存在争议，还有待进一步研究。

3.5miRNA相关途径 miRNA是由19～22个核苷酸组成的非编码单链RNA，由于其在血液、尿液及其他体液中的稳定性，成为各种疾病的新型生物标志物，也是肾缺血再灌注损伤的研究热点之一。在肾缺血再灌注损伤大鼠模型中发现，肾缺血再灌注损伤后血浆中的miR-192水平增加4倍，肾脏中的miR-192水平降低约40%，肾脏中miR-192表达在再灌注后7 d保持在低水平[58]。而小鼠模型中，尿miR-10a和miR-30d浓度与急性肾损伤的严重程度呈正相关[59]。这些研究表明，miRNA与肾缺血再灌注损伤密切相关。另外，在体内及体外肾缺血再灌注损伤研究中均发现miRNA参与了自噬的调控[9]。Liu等[60]在通过缺血再灌注建立的急性肾损伤小鼠体内模型中发现，小鼠肾缺血再灌注损伤后，miR-34a表达上调，且miR-34a可以直接与Atg4B的3′非翻译区结合，通过Atg4B靶向调节自噬活性，从而加重肾缺血再灌注损伤。同时，研究还发现，在肾缺血再灌注损伤期间，miR-21水平升高，且miR-21抑制剂预处理可增强LC3Ⅱ和Beclin-1的表达，减轻肾损伤，而miR-21是通过Rab11a靶向抑制肾缺血再灌注损伤中的自噬的[61]。而体外缺氧条件下，在肾脏近端肾小管HK-2细胞中检测到LC3Ⅱ和Atg16L1表达增加、miR-20a-5p表达降低，并发现miR-20a-5p通过Atg16L1靶向介导缺氧诱导的自噬[62]。由此可见，miRNA可以作为信号分子参与肾缺血再灌注损伤的病理生理过程，未来miRNA可能成为急性肾损伤潜在的治疗靶点。

4 小 结

自噬与肾脏缺血再灌注损伤密切相关，阐明肾脏缺血再灌注损伤与自噬相互作用的分子机制以及在自噬途径中的特定靶点，有助于为预防及治疗肾脏缺血再灌注损伤的药物研发寻找新的靶点。但目前仍有许多问题亟待解决，如自噬在肾脏缺血再灌注损伤中的研究多局限于细胞及动物模型，目前的研究结果在人的肾脏中是否可以得到相似的结论尚缺乏临床实践。研究者倾向于自噬在急性肾损伤中具有保护作用，但不能简单地理解为提高自噬就有利于急性肾损伤，其作用机制涉及多条信号通路及作用途径。另外，自噬在肾脏缺血再灌注损伤中的研究成果如何向临床转化还需要研究者们继续探索。