活性氧类在声动力疗法中的研究进展

闫春阳，王碧琳，毕良佳

(哈尔滨医科大学附属第四医院口腔科，哈尔滨 150001)

声动力疗法(sonodynamic therapy，SDT)是由超声联合化学药物声敏剂，生成活性氧类(reactive oxygen species，ROS)并产生抗肿瘤效应的一种非传统治疗方式。ROS是一种可以使周围底物被氧化的高反应性试剂，可使靶组织产生一系列不可逆性损伤[1]。SDT于20世纪80年代末由Umemura等[2-3]首次提出，是基于光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)和超声基础上发展而来的新型微创且安全有效、性价比较高的特异性疗法。SDT工作原理与PDT相近，均以ROS作为主要产物，但SDT在临床中优于PDT，关键在于SDT将超声作为外源性激发源替代PDT中的光刺激，而且与PDT以线粒体作为靶细胞相比，SDT更注重以线粒体及线粒体的膜结构作为重点[4-6]。同时，与PDT相比，SDT的穿透能力更强[7](超声可以穿透几十厘米的软组织[8]，光的穿透单位仍以毫米居多)、费用更低(可在CT/磁共振成像时进行操作)、靶向给药更精确，而且减少了由光刺激导致的组织变性。SDT很好地结合了超声的无创性特点[9-10]，在临床上广泛应用。现就ROS在SDT中的研究进展予以综述。

1 ROS概述

1.1ROS的生物学特性 ROS是细胞内声敏剂在SDT作用下的产物，在肿瘤、炎症及动脉粥样硬化的诊疗中均具有重要意义。ROS的主要代表物包括羟基自由基、过氧化物、超氧化物、单线态氧、次氯酸盐以及脂质过氧化物等高活性分子。ROS的半衰期长短决定了ROS的作用范围及细胞毒性效应，其中羟基自由基是氧化性能最强的ROS分子，可直接对细胞核酸及蛋白质造成损害，而单线态氧是破坏性极强的ROS，这些主要产物在适当的微环境下能够进行相互转化，完成ROS的清除[11]。例如，细胞内的超氧化物主要是由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)与NADPH氧化酶发生反应及细胞自身线粒体代谢共同产生的，而生成的超氧化物可在超氧化物歧化酶作用下生成过氧化物，当过氧化物积蓄到一定浓度时可在金属阳离子(锰离子、铜离子、锌离子)的作用下生成羟基自由基；同时，生成的过氧化物又可在过氧化物酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽分子的作用下生成过氧化氢，ROS具有相互转化的特性，增加了反应的复杂性[12]。

1.2ROS的来源 ROS可由NADPH氧化酶和线粒体代谢产生，也可通过光刺激和声刺激激发产生。根据产生的条件不同，ROS可分为内源性ROS和外源性ROS。内源性ROS主要由机体自身产生，另外，胞内细胞器(线粒体产生约占总ROS产量的90%[13]、内质网等)、酶体系(过氧化物酶)[14]、巨噬细胞及粒细胞等也有产生ROS的能力。外源性ROS则是由外界环境(如超声、光、药物)刺激产生，外源性ROS主要有能量转移和电子转移两种产生方式。

1.3ROS的双面性

1.3.1重度氧化应激反应 ROS的产生对细胞有双面性[15]，高水平、大剂量ROS因具有强氧化性，因此杀伤作用强，最终可导致不可逆性损伤、癌变[16]或者促进肿瘤的存活[17]，在强侵袭性、容易转移、不易根治的肿瘤疾病中表达增强。当细胞受到微环境刺激或抗氧化系统失调生成ROS过量时[18]，细胞内ROS的产生可破坏大分子生物的完整性，引起细胞损伤，产生氧化应激反应[19]，对细胞内的线粒体DNA具有损伤作用，诱导细胞凋亡[20]、坏死、衰老以及增殖阻滞[21]。

1.3.2轻度氧化应激反应 低水平、小剂量的ROS是机体内普遍存在的一种生理形式，发挥细胞内信号转导的作用，可作为生物的第二信使，对支持细胞生命活动起重要作用，通常以可逆化氧化蛋白巯基基团作为信号转导分子，使生成和清除的ROS维持动态平衡[22]。ROS的清除主要依赖于非酶类抗氧化分子(组氨酸)和ROS清除酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶)[23]。

1.4ROS常见的检测手段

1.4.1直接检测法 由于单线态氧的活性寿命极短，产量低，不易检测，目前直接检测方法主要包括带滤光片的近红外光谱分析仪和以磷光体作为荧光屏的近红外光光电倍增管扫描仪(原理是检测1 270 nm时单线态氧发出的磷光)。带滤光片的近红外光谱分析仪根据记录时间的长度分为多通道计数法、门控光子计数法以及时间相关单光子计数法。多通道计数法因具有采集时间短、范围广、时间精准(可精确到1 ns)等特点，是主要的检测方法[24]。

1.4.2间接检测法 间接检测法以探针(荧光探针、化学发光探针)作为主要手段进行荧光检测，但存在细胞毒性，因间接检测探针能与其他蛋白质发生反应，导致结果不准确。目前市面上常用的探针包括9,10-蒽二丙酸荧光探针[25]、1,3-二苯基异苯并呋喃荧光探针以及红色线粒体超氧化物荧光探针等，其中红色线粒体超氧化物荧光探针是常见的测量超氧化物的荧光探针[26]。化学发光探针通过与单线态氧的结合迅速发光释放能量，通过对发光信号的检测，得到单线态氧的含量。目前，含蒽衍生物发光探针是主流探针。

1.5ROS的不足 目前ROS的不足主要包括：①扩散距离短，存在还未到达靶组织就被清除的可能性，且单线态氧在细胞微环境中的扩散距离仅为45 nm，这种扩散程度不足以穿透细胞单层膜结构；②寿命短，单线态氧是最具破坏性的ROS，但在水溶剂中单线态氧的寿命仅为3.5 μs；③有氧环境对SDT中超声激活声敏剂产生ROS至关重要，因而是否存在有氧环境对SDT中ROS的疗效影响较大；④ROS会被特定的淬灭剂作用产生淬灭，如D-甘露醇和叠氮钠；⑤ROS的大量产生依赖于外界刺激(如光刺激)，但外界这种不正常的刺激会对人体造成伤害[27]。目前纳米声敏剂载体仍作为ROS靶向运输的通路应用于SDT[28]。

2 ROS-SDT的作用

正常生理功能下，细胞内产生和代谢的ROS处于平衡稳定状态，能够诱导细胞有丝分裂、消除炎症反应，且不产生细胞毒性。SDT采用的声敏剂主要来源于PDT的光敏剂，光敏剂的靶向作用位点不同则作用机制不同。研究表明，当光敏剂作用于线粒体时，极低量的PDT即可激发线粒体的呼吸传递链，使生成的ROS对细胞凋亡起到重要作用[29]。当光敏剂的靶向位点为线粒体和溶酶体时，可激发细胞凋亡机制，使细胞发生凋亡；当光敏剂的靶向位点为细胞的内质网时，则会发生自噬现象；当光敏剂的靶向位点为细胞膜时，则直接导致细胞死亡[30-31]。血卟啉单甲醚是应用较广的声敏剂，超声与血卟啉单甲醚结合时，可产生ROS，进而激活胱天蛋白酶(caspase)-3、caspase-9、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)等通路，诱导DNA断裂、促凋亡细胞高表达[32]。

2.1ROS-SDT的功能性效应 SDT中ROS的生成是基于SDT超声空化作用中的惯性空化效应。超声空化作用是一种独特的物理现象，是超声作用于液态组织时产生的动态过程。空化作用作为SDT的主流效应，可分为两种类型，即非惯性(稳定)空化效应和惯性(瞬态)空化效应[33]。在稳定空化下，超声的频率占主要因素，气泡直径的变化甚微，主要表现为产生的气泡不会剧烈变化导致坍塌，且存在周期较长；气泡以被迫振动为主要振动方式，在外界环境的改变下，膜渗透性增高[34]。在惯性空化中，液体气泡吸收大量的超声能量，且在极短的时间内急剧释放，气泡先收缩后膨胀至其共振尺寸的2～3倍，最后压缩在半周内，可在短时间内产生高热，经历强烈超声的辐射，形成自由基[1]。当细胞受到外源性的强烈刺激时，会对自身结构和支持代谢的酶产生不可逆性的损伤[35-36]。同时，为了提高SDT的治疗效果，需要对超声的频率、强度及声敏剂的靶向性更加关注。

因对周围组织的损伤情况不同，稳定空化效应是目前研究的重点生物学效应，这使得低频、低强度(<1 MHz、3 W/cm2)的超声成为主流。SDT可激活Bax/Bcl-2异二聚体或Bax/Bax同源二聚体、Fas/FasL信号通路的高表达以及caspase-8和caspase-3升高等一系列变化[37]。以上生物学效应导致组织中的水分子裂解产生自由基(如羟基自由基、单线态氧)等ROS，这些物质联合声敏剂及超声协同杀灭靶细胞[38]。ROS可以损伤脂质与蛋白质的特性，表明SDT下产生的ROS在细胞水平上产生了实质性改变。

2.2ROS-SDT的作用机制 首先，SDT诱导细胞内ROS产生，使线粒体膜电位下调，导致线粒体不能进行正常的氧化磷酸化和腺苷三磷酸的合成步骤，诱导细胞凋亡[19]。其次，SDT的激发使线粒体膜上的Bax高表达和Bcl-2低表达，Bax与Bcl-2呈拮抗关系，Bax可促进细胞凋亡，Bcl-2起到抑制细胞凋亡的作用，Bax通过形成Bax/Bcl-2异二聚体或Bax/Bax同源二聚体方式增加线粒体膜的通透性，导致内源性凋亡的可能；同时，SDT的存在使线粒体生物膜上钙离子含量增高呈过载状态，当钙离子含量超过阈值时，细胞膜破裂并不再完整[39]。线粒体膜电位的降低可促进ROS生成，产生细胞毒性[7]。这些均证明SDT对ROS的产生具有正向促进作用。

2.3SDT介导ROS产生的过程 SDT介导ROS产生的过程主要包括：①生物相容性良好的声敏剂先与靶组织结合；②超声在特定区域内产生机械效应；③超声与声敏剂相结合产生空化现象、热效应及机械效应，使介质震荡，同时超声照射靶组织；④短时间内的局部高压环境使介质中的气泡崩塌，产生大量热能、羟基自由基阴离子和氢离子[40]；⑤声敏剂同崩塌的细胞相结合产生电子跃迁，电子从激发态回到基态时，伴随能量的释放，产生杀死靶细胞的ROS物质[7]；⑥ROS产生氧化应激反应，导致细胞核酸、脂质及蛋白质损伤[25]。

2.4ROS在SDT中的应用 SDT作为一种安全、无创、无毒的新型疗法，在临床中应用广泛。SDT作为PDT的延伸，使用特定的、对周围组织不产生损害的声波来代替PDT中的光波，增加了定位准确性。同时，使用特定频率、波长及强度的超声与集聚在靶组织中的声敏剂相结合形成的SDT可以弥补单纯超声及PDT的局限性。Li等[41]对荷瘤小鼠模型肿瘤安全消融的研究表明，当黑磷[42]纳米片作为声敏剂载体时，可产生优势性的羟基自由基阴离子，与外界环境添加的过氧化物产生协同作用，在黑磷纳米片上生成ROS；以2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐作为ROS敏感荧光探针，结果发现，在53 kHz、0.14 W/cm2的超声和0.05 mg/L的黑磷纳米片作用下单线态氧和过氧化物均高表达，肿瘤体积显著缩小。Li等[43]以硫化银作为声敏剂，以红细胞(在哺乳动物体内能进行氧气运输，具有过氧化氢酶的特性，可避免产生有毒物质)作为载体作用于肿瘤细胞，结果显示，在SDT刺激下肿瘤内的氧分子转化为氧自由基和单线态氧，可有效消除肿瘤，提高小鼠存活率。Yang等[44]以全氟戊烷为核心，将血卟啉单甲醚与叶酸(folate，FA)结合到含有磷脂的细胞膜中作为声敏剂与纳米脂质体(nanodroplets，NDs)相结合形成FA-H@NDs系统，并通过光声成像系统进行检测，结果发现，FA-H@NDs系统经声致相变后转变成气泡，进一步增强了超声和纳米脂质体的穿透能力，同时FA-H@NDs系统在超声照射下可诱导ROS产生，导致人卵巢癌SKOV3细胞抑制率显著增高，进而导致肿瘤细胞和组织凋亡、坏死，表明SDT介导产生的ROS对肿瘤的治疗效果显著。

3 小 结

ROS主要存在于生物自身组织细胞中，小剂量的ROS并不能对机体细胞代谢产生负向作用。SDT主要通过超声机械压力、超声与声敏剂结合产生ROS诱导细胞凋亡、空化效应三者协同破坏靶细胞。SDT是继传统手术疗法、药物疗法后最具潜力的疗法。SDT因声敏剂选择的差异性、超声的强度、频率参数的不同以及对热效应与空化效应检测的缺失性而具有限制性。未来应明确ROS产生与SDT机械效应的机制，优化空化效应，以减少其他不必要的机械效应对能量的削弱。