循环肿瘤细胞在上皮性卵巢癌诊治中的进展

秦昭娟，杜逸，郑艾

卵巢癌死亡率在妇科恶性肿瘤中占第一位。据2019 年的统计，美国每年新发卵巢癌患者约22 000例，其中死于卵巢癌的病例数约14 000 例[1]。卵巢癌发病隐匿，约70%的患者被发现时已经进入中晚期。虽然当前卵巢癌的诊治水平进一步提高，由于手术缩瘤不满意、术后复发和化疗耐药等，卵巢癌5 年生存率普遍低于30%。目前血清CA-125 是卵巢癌最敏感的标志物，但女性孕期、子宫内膜异位等情况均会造成血清CA-125 的升高，CA-125 对卵巢癌诊断假阴性的比例较高[2]。90%来源于卵巢上皮细胞的卵巢恶性肿瘤为上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）。早在1896 年Ashworth 首先提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的概念，CTC作为一种新型的肿瘤标志物，具有获取样本容易、创伤小、可重复的优点，且在多种类型的肿瘤如肺癌、乳腺癌等已证实其具有早期诊断、评估抗肿瘤药物疗效及判断患者预后的价值[3-4]。CTC 由原发灶进入血液被认为是肿瘤转移的早期事件[5]，大部分CTC被免疫系统清除，部分幸存的细胞到达远处器官形成转移灶。目前EOC 的CTC 检测得到广泛研究，现主要探讨几种典型的上皮性卵巢癌CTC 捕获和鉴定的方法，CTC 在EOC 诊治中的临床意义及其临床应用转化的前景。

1 CTC 的表面标志物

CTC 的检测首先需要选择其表面标志物。CTC的形成与上皮间质转化有着密切关系。在此过程中，肿瘤细胞的上皮性质标志物如上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和细胞角蛋白（cytokeratin，CK）表达减少，间质细胞标志物如波形蛋白的表达增加，这种转变有利于减少肿瘤细胞间的黏附，促进CTC 的产生并向邻近或远处器官组织侵袭转移。血液中的CTC 大致分为上皮型、混合型和间质型，若在血液中发现较多混合型或间质型CTC 可能预示患者转移复发的风险更大[6]。常用的CTC 表面标志物包括EpCAM、切除修复交叉互补蛋白1（excision and repair of cross complementary protein 1，ERCC1）和CK 等。EpCAM 为非钙离子通道依赖性跨膜糖蛋白，其生物学功能包括细胞黏附、增殖、维持未分化状态以及调节分化等。在EOC 中EpCAM 高表达，也是最常用的CTC 检测标志物之一。ERCC1 参与核酸切除修复途径，介导机体对铂类化疗药物的抗药性和敏感性，是卵巢癌铂类化疗药物可能的耐药机制之一。Chebouti 等[7]的研究发现ERCC1 是一个独立的预测卵巢癌铂耐药性和不良预后的生物标志物。CK 广泛应用于标记各种上皮来源的组织和肿瘤细胞，通过分析CK 亚型有助于确定肿瘤病理类型。人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是表皮生长因子受体家族酪氨酸激酶受体的成员之一，在肿瘤生物学过程中起着关键作用[8]，HER2 过表达与卵巢癌不良预后相关。黏蛋白1（Mucins 1，MUC1）是一种高分子质量的糖基化的1 型跨膜糖蛋白，在正常卵巢组织中不表达，在所有组织类型的原发性卵巢癌中均表达，在EOC 中表达率可达90%。当卵巢肿瘤从良性变为恶性，MUC1 表达上调。Aktas 等[9]的研究中卵巢癌患者手术前和化疗后外周血中CTC 表面MUC1 的表达率分别为50%和47%。MUC16 主要发挥保护和修复上皮的作用。MUC16 可以通过与间皮素结合，抑制肿瘤细胞和免疫细胞，形成免疫突触，促进卵巢癌远处转移[10]。MUC16 与EOC 细胞的上皮-间质转化、EOC 的肿瘤形成及转移关系密切。

CTC 的检测常受到血液中大量白细胞和原发肿瘤异质性的影响。EpCAM 虽然是目前检测EOC 中CTC 最常用的肿瘤标志物，但因其在不同CTC 中表达水平的变化，仅基于EpCAM 进行CTC 检测，可能丢失一些CTC 亚型[11]，导致检测的敏感度低。在分析对比了多种研究的基础上，Zhang 等[12]发现联合使用EpCAM、HER2 和MUC1 进行检测效果最好。通常来说，联合使用两种及以上的标志物将提高CTC 在血液中的富集效率。

2 CTC 的检测方法

理想的CTC 检测系统能够在血液中的强大背景中分离检测血液所有异质性的CTC。Yousefi 等[13]比较了最近十年关于EOC 的研究结果发现CTC 的检测率约为12%～43%，发生上皮-间质转化后的卵巢癌CTC 具有多样的生物学行为。由于CTC 的稀有性以及单个细胞中存在的核酸以及细胞间的异质性[14]，在运用CTC 检测技术诊断肿瘤时面临巨大挑战。CTC 检测包括CTC 的分离与检测两个部分。首要是CTC 在血液中的分离，以物理特性为基础的CTC 分离方法包括密度梯度离心法、上皮肿瘤细胞体积分离法、膜滤过分离法和细胞变形性富集法等；基于电子信息技术的CTC 分离方法主要包括免疫磁珠法、微流控芯片法和光纤阵列扫描法等，主要是利用抗原抗体结合原理对CTC 进行富集。

2.1 物理分离方法密度梯度离心法是利用CTC在配制的分离液与正常血液细胞沉降系数不同，通过离心技术将不同密度的细胞区分在不同区域，红细胞、粒细胞密度比CTC 大，离心后会沉于管底；淋巴细胞和单核细胞密度小于或等于分离介质，因此离心后悬浮于介质中漂浮于上层，CTC 也留存于单核细胞富集层。膜滤过分离法是基于CTC 比正常血细胞的体积大，采用8 μm 孔径的滤膜将CTC 聚集在滤膜上，但血液中体积较大的正常血细胞同时也会被富集而造成假阳性。物理分离后CTC 仍保留活力，缺点是缺乏特异性，富集后的细胞需要进一步检测排除假阳性，因而限制其运用。

2.2 Cell Search 系统目前大多数的临床CTC 研究资料来自于唯一被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的Cell Search 系统，是衡量其他CTC 检测方法的标准。原理是利用EpCAM 抗体免疫磁珠富集7.5 mL 外周血中的CTC[15]，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核染色，CK8、CK18 和CK19 荧光抗体标记上皮细胞，CD45荧光抗体识别白细胞。符合肿瘤细胞学形态特征并且CK 荧光抗体阳性、DAPI 阳性和CD45 阴性的细胞被定义为CTC。其截断值为2 个细胞。Cell Search系统只能检测EpCAM 阳性的细胞。Yoo 等[16]将高密度的透明二氧化硅制作的微珠与EpCAM 抗体结合，之后CTC 和微珠的复合体再利用密度梯度离心法与其他细胞分离，可以分离出低表达EpCAM 的CTC细胞。2017 年获得国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准上市的Cell Collector[17]富集技术是将包被EpCAM 抗体的Cell Collector 功能区装置通过留置针插入患者的静脉，保持30 min 富集CTC，该技术是目前效率较高的CTC 富集技术。

2.3 免疫磁珠法基于细胞上皮表面抗原与连有免疫磁珠的特异性单抗相结合，形成抗原-抗体-磁珠复合物。血液中几乎所有的细胞都是反磁性或者弱磁性的，在磁场的作用下，可将特定的肿瘤细胞进行分离。抗体的选择是免疫磁性分离技术重要环节，单用EpCAM 作为检测标志的文献报道较多，部分报道运用EpCAM 与CK 联合检测，EpCAM 与HER2、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MUC1 抗体组合对EOC 进行检测，均获得较高的分选效率。国内有研究采用阴性免疫磁微粒法检测健康人群与EOC 患者血液中的CTC，结果显示EOC 组的CTC 阳性率为90.22%，且随着肿瘤分期的进展检测出的CTC 数目更多，CTC 计数与EOC 临床分期具有相关性[18]。免疫磁性分离技术的优点能够较好保存细胞形态，并可在荧光显微镜下观察。

2.4 微流控芯片基于微流控芯片的分离方法通过在芯片通道内部修饰可识别细胞表面抗原的抗体或核酸适配体，当接入待测样本时，目标标志物与通道表面捕获试剂结合，实现特异性分离。Tsai 等[19]采用以卵巢癌CX-BG1-10-A 适配体包被的磁珠来捕获血液的CTC，明显减少混杂的白细胞数量，假阳性率比Cell Search 检测方法低至少两个数量级。Tang等[20]将微流系统和免疫磁性分离技术结合，其CTC的捕获效率提高到94%，同时保留捕获细胞的形态，捕获的CTC 可在显微镜下进行原位观察，与免疫纳米磁珠分离后的CTC 还可继续培养观察。Obermayr等[21]结合密度梯度离心和浓缩、ParsortixTM微流体技术及实时荧光定量聚合酶链反应富集CTC，消耗CTC 中污染的白细胞，提高了CTC 富集的纯度，从而为临床研究中CTC 的检测和分子表征的探索进一步提供了可靠的理论依据。

2.5 石墨烯材料石墨烯材料是一种由碳原子构成的单层片状结构的二维纳米材料，具有良好的生物相容性，可用以固定抗体分子，制成生物传感器。石墨烯的表面可以被芳香族苯环非共价修饰，修饰后的石墨烯电传导性发生改变，可以放大生物学效应，提高探测的敏感度。以纳米结构为基础的氧化石墨烯芯片检测技术，使用高传导性的石墨烯纳米片材料富集CTC 的微流体设备：通过单向磁泳从血细胞中分离出CTC，然后通过电阻信号的变化从富集细胞样本中鉴别CTC[22]。石墨烯纳米片可以改变CTC 表面的传导性，因此可以提高电信号检测的精确性。Han 等[23]利用纳米石墨烯材料研究出了基于两种不同的电化学信号——振幅和相位差异的微流体设备来分离和检测CTC，通过细胞大小和石墨烯纳米板表面结合的CTC 的电学性质改变的相位差来鉴定CTC。目前，对于石墨烯材料用于CTC 的检测方法仍在进一步研究中。

2.6 CTC 鉴定方法将血液中可能的CTC 分离出来后，鉴定CTC 的检测方法则基于CTC 的生物化学或者生物物理的特性，以及CTC 与白细胞表面的抗原特性的差异，通过免疫细胞化学技术、流式细胞分析、细胞化学染色荧光原位杂交技术、聚合酶链反应、测序等技术对其鉴定。逆转录聚合酶链反应主要检测外周血中特异mRNA 的表达，但只能定性而不能定量[24]。激光扫描细胞仪作为高通量版的流式细胞仪，可在较短时间内（1 h）自动检测5×104个细胞，并能全面分析CTC 内部微结构，连续扫描成像产生可视化数据，现已发展成标准化操作程序分析，是目前CTC 定量检测的最佳方法。

3 CTC 在EOC 中的临床应用价值

3.1 CTC 与CA-125 早期诊断预测EOC 的效果Zhang 等[12]应用免疫磁珠联合多重逆转录聚合酶链反应分别检测109 例新诊断为EOC 患者血液中CTC 和CA-125 的表达情况，CA-125＞35 U/mL为阳性，结果显示CTC 的阳性率为98%，其中在ⅠA、ⅠB 期患者CTC 和CA-125 的阳性率分别为93%和64%，说明在早期卵巢癌患者检测CTC 发现卵巢癌的敏感度较CA-125 更高。2017 年一项前瞻性研究报道了87 例不确定良恶性附件包块的患者，术前CTC 的富集和检测区分卵巢良性肿瘤与卵巢恶性肿瘤的敏感度为77.4%[25]。在一组118例确诊为卵巢癌患者中77 例（65.2%）成功分离出CTC，捕获到了可能有助于诊断不同组织学类型卵巢癌亚型增殖潜能的细胞[26]。上述研究表明，CTC 检测能在很大程度上提高EOC 早期诊断的敏感度和特异度，血液中检测到CTC 与卵巢癌的不良临床结局、CA-125 和人附睾蛋白4（HE4）升高相关[27]。

3.2 治疗效果的监测研究已证实CTC 的检测可以判断肿瘤的预后[28-29]。CTC 的检测与肿瘤负荷明显相关，且晚期肿瘤的CTC 检出率高于局限性肿瘤。在129 例未接受治疗的患者中，CTC 检测Ⅰ期和Ⅱ期EOC 恶性肿瘤的敏感度为41.2%，特异度为95.1%，阳性预测值为77.8%，检测EOC 所有期次恶性肿瘤的敏感度为83%，阳性预测值为97.3%，且与肿瘤分期、复发和死亡方面有显著差异，与化疗反应及生存相关[30]。另有研究发现，123 例EOC 患者血液样本CTC 计数的变化与治疗反应高度相关，随访期间CTC（79.5%）的增加比CA-125（67.6%）更敏感预测进展或复发；此外，CTC 的存在与较短的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progress free survival，PFS）显著相关[31]。Lee 等[32]研究了54 例EOC患者，发现检出CTC≥3 个细胞的患者PFS 下降。最近的一项荟萃分析研究了来自8 项研究的1 184 例卵巢癌患者，结果表明CTC 阳性的患者OS（HR=2.09，95%CI：1.13～3.88）和PFS（HR=1.72；95%CI：1.32～2.25）降低，预后较差[33]。Blassl 等[34]研究认为CTC可用于预测EOC 远处转移和复发。因此，对于卵巢癌CTC 的检测可以用于治疗期间的随访，判断疗效、预测疾病复发等。

3.3 CTC 用于指导EOC 精准治疗Aktas 等[9]研究发现，卵巢癌患者CTC 表面的分子标志物或肿瘤抗原可作为生物靶向治疗可能的靶点。程序性死亡配体1（PD-L1）能在卵巢癌、结直肠癌和恶性黑色素瘤等多种肿瘤中表达。肿瘤细胞通过免疫抑制机制来阻止免疫细胞消灭异常细胞而生长，免疫细胞对CTC 的生存能力有影响，PD-L1 的表达减少导致转移病灶形成减少[35]。Buderath 等[36]与健康对照者相比，在EOC 患者中可溶性PD-L1 的表达增加，与肿瘤负荷正相关；可溶性PD-L2 表达减少，与铂耐药相关。分离酶（Seprase）是表达于侵袭性循环肿瘤细胞（invasive circulating tumor cell，iCTC）表面的标志物，抗分离酶实验表明iCTC 可促进原发灶肿瘤细胞侵入血液形成远处转移[37]。Geethadevi 等[38]研究表明从血液中捕获酪氨酸激酶受体阳性的CTC 可用于肿瘤细胞的基因组和蛋白质组学表征分析，有助于设计癌症治疗方法，确定癌症患者对化疗药物效果和耐药机制。此外，检测CTC 还可以研究肿瘤细胞转录的mRNA 和表达的蛋白质，这些蛋白质可能成为抗肿瘤药物的作用靶点。

4 结语

提高目前卵巢癌的诊治效果需寻求一种高敏感度、特异度的早期肿瘤标志物，卵巢癌CTC 的检测可以为快速和准确诊断疾病、治疗反应的实时监测过程提供新的思路。CTC 检测的优势除了研究DNA序列分析外，还能研究肿瘤细胞表达的mRNA 和蛋白质，而许多蛋白质是抗肿瘤药物的实际靶点，可用于个体化治疗。CTC 已在许多类型的癌症中显示出预后价值，并在EOC 中显示出比CA-125 更好的监测工具价值，CTC 可能成为一种越来越有价值的EOC 检测工具，特别是在早期阶段。目前的检测方法大多是基于肿瘤细胞表面的抗原抗体反应捕获CTC，如何筛选鉴别不同肿瘤细胞的标记物仍是一个巨大的挑战。其次，随着科学技术的发展，一系列有前景的新方法已经出现，能够提高血液中CTC 的检测和分离水平。目前在早期卵巢癌患者的血液中检测出CTC 的阳性率普遍较低，且结果判断存在争议，因此仍然需要继续研究出更为完善的CTC 分离与检测系统。尽管血液CTC 作为一种潜在的诊断和预后的生物标志物已被广泛研究，但其固有的稀少性和异质性给开发具有临床显著特异度和敏感度的CTC 检测方法带来了巨大的挑战，目前仍然缺乏一个统一客观的标准建立依赖阈值的标准化CTC 诊断技术，因此，定量评估CTC 可以发挥其高预后价值和检测耐药或进展风险增加的能力。