成纤维细胞来源外泌体在疾病相关细胞外基质重构中的作用

胡佳琦 谢臻蔚

浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江省杭州市 310000

成纤维细胞是介导细胞外基质(Extracellular matrix， ECM)重构的重要细胞类型，可产生胶原、弹性蛋白等组成ECM，亦可分泌其降解关键酶——基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)等分解ECM。当成纤维细胞调控ECM重构过程失衡时，将引起ECM过度沉积或过度降解，导致器官纤维化、炎症、皮肤衰老及肿瘤侵袭等[1-2]，但其具体调控机制尚不明确。外泌体是一种新型胞间通讯方式，新近研究发现，成纤维细胞来源的外泌体可携带胶原、MMPs等参与ECM组成及代谢[3-4]，还可以自分泌形式区域性调控成纤维细胞功能，在局灶ECM重构中发挥关键作用，为人体多种疾病病因机制和治疗靶点研究带来了新思路。

1 成纤维细胞外泌体简介

外泌体(Exosomes)是一类由多种细胞内体—溶酶体途径产生、直径40～160nm的胞外囊泡[5]，可聚集并传递蛋白、脂质及遗传物质等，类似“号富集器”。由于外泌体具备特有的囊泡结构，保证了信号群转移的完整性，使胞间信息传导更精准和全面[5-6]，因此，其在维持局灶微环境稳态中的作用日益被关注。

在病理及生理情况下，成纤维细胞均可分泌外泌体[7]。早在2006年，Zhang等采用密度梯度离心法成功获得人滑膜成纤维细胞来源的外泌体[8]。其后，随着超滤法、超速离心法、基于聚合物的共沉淀法等外泌体提取技术的发展，许多学者在支气管、肌肉、滑膜、肝脏等多种组织中获得成纤维细胞外泌体[9-13]。目前，成纤维细胞来源外泌体鉴定方法已较成熟，主要包括以下3点：(1)大小30～100nm[9]；(2)形态为经典的“杯状”；(3)表达外泌体相关蛋白标志物。现较明确的外泌体蛋白标志物主要有：肿瘤易感性基因101蛋白、热休克蛋白70、凋亡诱导因子相互作用蛋白、四跨膜蛋白质CD9、CD63和CD81。波形蛋白是成纤维细胞的蛋白标志物，若提取到的外泌体出现波形蛋白，则可认为该外泌体来源于成纤维细胞[10-11]。以上多种鉴定方法的成熟运用为成纤维细胞外泌体的深入研究奠定了基础。

2 成纤维细胞外泌体与ECM重构

ECM是广泛存在于人体多种组织中的动态结构，在应激条件下，通过不断的重构以维持组织微环境稳态[14]。ECM主要由胶原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等组成[14]；并可被多种蛋白酶降解，包括MMPs、聚蛋白多糖酶、组织蛋白酶、肝素酶和硫酸酯酶等[1]，其中，MMPs及其抑制剂(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是其降解关键酶。ECM重构过程中的主要环节是组分的合成和降解，其他还包括组分的组装和化学修饰[1]等。

研究显示，成纤维细胞外泌体可能通过参与ECM合成和降解等机制参与ECM重构。2017年，有学者基于高分辨质谱技术，将人正常伤口中分离出的肌成纤维细胞的胞外囊泡进行蛋白质组学鉴定及功能分析，发现其中涉及细胞外基质组成的蛋白—胶原分子[4]，且成纤维细胞来源的外泌体内携带有MMPs-TIMPs[3]。另有学者对肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)外泌体进行高通量测序，鉴定出了其中含有种类丰富的长链及短链非编码RNA，且外泌体内miRNA与ECM重构的发生相关[7,11]。此外，成纤维细胞外泌体还可以自分泌方式参与ECM重构。将纤维化肺组织来源的原代人肺成纤维细胞分泌的外泌体作用于正常人肺成纤维细胞，观察到外泌体处理后的细胞内纤连蛋白、Ⅰ型胶原和肌腱蛋白C等ECM蛋白的基因表达下降[15]。上述对成纤维细胞外泌体内容物的研究，提示成纤维细胞来源外泌体参与ECM组成和代谢，并存在自分泌作用，是ECM重构的重要调控方式。

3 成纤维细胞外泌体在不同疾病相关ECM重构中的作用

越来越多的研究表明，成纤维细胞来源外泌体携带蛋白、RNA等信号分子，通过传递胞间信息来调控ECM重构，参与组织损伤修复、细胞迁移等病理生理过程，与皮肤老化、肿瘤、炎症等疾病密切相关。部分证据显示，外源性给予成纤维细胞来源外泌体，可改善组织ECM重构病理状态，有望治疗疾病，具潜在临床应用价值[16-17]。

3.1 成纤维细胞外泌体与皮肤衰老 ECM重构紊乱导致其胶原组分改变是皮肤老化的重要特征[18]。紫外线照射下，皮肤Ⅰ型前胶原分子合成减少而MMPs合成增加，使局部组织胶原蛋白缺乏，从而引起皮肤弹性缺失、产生皱纹。皮肤成纤维细胞可分泌外泌体，促进Ⅰ型前胶原分子及TIMPs的表达，通过介导ECM重构改善皮肤老化现象。Hu等[16]通过构建紫外线诱导皮肤衰老的小鼠模型，在其背部皮肤局部注射人真皮成纤维细胞外泌体，发现注射区域内胶原纤维丰富且致密、ECM重构蛋白MMP-1表达下调而TIMP 1-2表达上调，提示成纤维细胞外泌体可通过抑制胶原降解来改善皮肤胶原含量。

成纤维细胞来源外泌体对皮肤衰老具有潜在的治疗前景。尤其是研究发现，小鼠局部皮肤注射人真皮成纤维细胞外泌体比注射间充质干细胞外泌体，更能增加局部组织内Ⅰ型前胶原分子表达[16]，其具体机制可能与转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α等因子表达改变有关。其中，TGF-β是公认的ECM生物合成的主要调节分子，可上调胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白等多种ECM蛋白的表达[19]。该信号转导异常将引起胶原蛋白合成减少、ECM重构障碍，使真皮中胶原蛋白呈碎片状、粗分布[20]。而外源性人真皮成纤维细胞外泌体注射可促进小鼠皮肤TGF-β高表达。通过激活TGF-β信号通路，成纤维细胞外泌体发挥局部组织的抗衰老效应。

3.2 成纤维细胞外泌体与肿瘤 在肿瘤的发生发展过程中，ECM发生了重构，这种重构最重要的特征表现为ECM的分子组成的改变，重构后的ECM为肿瘤细胞的增殖、分化创造了一个宽松的微环境，导致肿瘤细胞转移和浸润生长[21]。其中，MMPs的水解作用是导致 ECM 重构的主要原因。

CAFs是肿瘤组织中持续活化的成纤维细胞，其所产生的外泌体在肿瘤微环境中起信号转导作用，诱导细胞外基质降解和重构。研究显示，口腔鳞状细胞癌组织中CAFs来源的外泌体内miR-34a-5p含量较正常成纤维细胞外泌体下降， miR-34a-5p可经外泌体途径传递至肿瘤细胞，直接结合于受体酪氨酸激酶AXL(Aexekleto，AXL)靶基因，经糖原合成酶激酶-3β/β-连环蛋白/锌指转录因子snail信号级联反应，调控E-钙黏蛋白和MMPs的表达[22]。将肿瘤细胞内miR-34a-5p分子过表达，发现肿瘤细胞内E-钙黏蛋白表达水平同样升高，MMP-2和MMP-9表达下降。已知基底膜由Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、蛋白多糖如聚集蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白等组成[14]，而MMP-2及MMP-9可参与其中多种成分的降解。因此，CAFs所分泌的含低水平miR-34a-5p的外泌体作用于口腔鳞癌细胞，经AXL/GSK-3β/β-catenin/snail信号通路，调控MMP-2及MMP-9的表达，从而参与基底膜降解，在肿瘤细胞的转移中发挥了重要作用。

3.3 成纤维细胞外泌体与炎症 炎症作为组织重构的重要驱动因素，导致了骨组织慢性重塑，其所导致的组织损伤与基质降解酶密切相关。MMPs在炎症条件下表达增加，活性增强，且与炎症的严重程度有关[23]。炎症组织中MMPs及含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs, ADAMTS)等酶的活化，参与基膜及间质胶原的降解，导致细胞外基质重构。

炎症组织中，成纤维细胞外泌体下调软骨细胞胶原表达，而促进胶原降解相关酶的表达，引起ECM过度降解。Kato等将白介素-1β(Interleukin，IL-1β)刺激人滑膜成纤维细胞，发现外泌体释放增加，将外泌体与关节软骨细胞共培养24h，结果显示，与未受IL-1β处理的成纤维细胞来源外泌体相比，IL-1β刺激组中软骨细胞内MMP-13、ADAMTS-5表达上调，聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达下降[13]。而在软骨关节中，ECM主要由Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖组成，MMP-13被认为是骨关节炎疾病中降解ECM的主要酶类，且ADAMTS-5具有降解蛋白聚糖的能力。两者的上调将引起骨关节中细胞外基质的过度降解，结合胞外基质成分合成减少，最终导致骨关节的破坏。在牙周炎进展中，Zhao等发现经脂多糖处理的成纤维细胞来源外泌体，可下调人成骨细胞内的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白等骨特异性基质蛋白的表达水平[24]，且Runt相关转录因子2与骨保护素的表达下降共同参与了胞外基质重构过程[25]。上述研究均提示成纤维细胞外泌体在炎症疾病ECM重构过程中发挥重要作用。

3.4 成纤维细胞外泌体与纤维化 纤维化是一种主要由成纤维细胞介导的过度细胞外基质产生和沉积的疾病，表现为胶原纤维的过度沉积，各类型胶原比例失衡，排列紊乱，可发生在多种组织器官中[1]。Ⅰ、Ⅲ型胶原的过度表达及早期胶原酶活性的增加，晚期活性的降低，导致胶原蛋白网络发生改变[26]。ECM合成和降解之间的失衡致使ECM重构障碍。

在肝纤维化疾病中，肝星状细胞作为损伤后分化为肌成纤维细胞的主要来源，经血小板源性生长因子刺激后，分泌富含血小板源性生长因子受体α的外泌体，以酪氨酸磷酸酶依赖性方式，促进体外HSCs的迁移和体内肝纤维化的发生[12]。在肺纤维化疾病中，人肺成纤维细胞来源外泌体以自分泌方式作用于成纤维细胞后，成纤维细胞代谢活性及增殖能力增强[15]。用TGF-β刺激人肺成纤维细胞，可增加外泌体内Wnt蛋白家族成员5a含量，进一步促进细胞增殖，参与肺纤维化进展。此外，miRNA也可经成纤维细胞分泌，经外泌体途径参与纤维化疾病的进展。在杜氏肌营养不良疾病中，肌组织成纤维细胞来源外泌体内所含的miR-199a-5p水平显著升高，将正常成纤维细胞与DMD成纤维细胞源性外泌体共培养后，细胞增殖能力增强，成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白、TIMP-1和TGF-β等纤维化相关基因转录水平上升，胞外胶原沉积增加[11]。然而，Shannon等发现活化的成纤维细胞来源的外泌体存在对邻近原始成纤维细胞的抗纤维化作用，且其内含有高水平的抗纤维化分子[27]。深入研究发现，过表达β-连环蛋白和转录因子Gata4的皮肤成纤维细胞来源的外泌体可减少小鼠胫骨前肌纤维化并改善小鼠运动能力[17]。因此，成纤维细胞外泌体内关键信号分子对纤维化的作用仍有待进一步研究。

4 展望

成纤维细胞是参与ECM重构的重要细胞，通过细胞与细胞间通讯，参与组织ECM成分合成与降解的稳态维持。外泌体作为胞间信号传递的一种方式，参与纤维化、炎症等疾病的进展。现认为成纤维细胞来源外泌体可以自分泌方式调控其细胞活性，而外泌体内携带的蛋白质、RNA等信号分子在ECM重构中可能发挥着至关重要的作用。在纤维化疾病的研究中发现，疾病组织中的成纤维细胞分泌的外泌体可促进正常成纤维细胞纤维化相关基因的表达。近年来，在皮肤衰老的研究中发现成纤维细胞来源的外泌体是一种极具前景治疗方式。因此，深入阐明成纤维细胞来源外泌体在ECM重构相关疾病中的作用，以外泌体为载体，从而改变病理状态下的细胞外基质，这将为更多的疾病治疗提供思路。