食品中志贺菌检测方法的研究进展

韦丽琴

（天峨县疾病预防控制中心，广西 河池，547300）

志贺菌病（Shigellosis），也称杆菌性痢疾，是一种主要由志贺菌（Shigella spp.）引起的急性直肠-结肠炎，临床症状表现为水样泄，粘液脓血便，里急后重，部分患者有剧烈头痛、嗜睡、意识模糊、惊厥等神经症状。近年来，随着生活方式与饮食结构的不断改变，我国感染志贺菌几率逐渐增加，据调查，全世界每年有1.6 亿左右人感染志贺菌，有110 万人左右因志贺菌死亡，其中以儿童最为常见[1]。在我国，志贺菌感染患病率为百万分之六十五[2-3]。食品中志贺菌主要是经过食用被志贺菌污染的食物而感染疾病，以全身中毒症状、大肠化脓性炎症以及溃疡等为主要临床特征，其主要经过消化道途径传播，侵袭肠上皮细胞，进而引起发热、腹泻、腹胀等症状，对患者身体健康与生命安全造成严重影响。目前最常用的志贺菌增菌液培养志贺菌标准菌株研究中，发现部分志贺菌生长量显著低于大肠杆菌等，且延迟期也较为落后。同时在普通校验培养基中部分痢疾志贺菌与鲍氏志贺菌生长不良，造成杂菌较多，因此极易引发误检与漏检[4]。故针对食品中志贺菌采取高效、准确性高的检测方法，对疾病的防控具有重要意义。现将食品中志贺菌检测方法的研究进展做一综述。

1.食品中志贺菌检测方法

近年来，随着生物实验技术不断发展，食品中志贺菌检测与鉴定技术也在逐渐完善，其中包括常规生化检测、快速生物检测仪器法、免疫学检测以及分子生物学检测。

1.1 常规检测技术

食物中志贺菌检测方式以国标法（GB 4789.5-2014）为主要检测方式，检验程序：增菌、选择性增菌、选择性平板分离培养，革兰氏染色、镜检，生化试验与血清学分离鉴定。此种检测方式主要为微生物培养法，操作方式较为繁琐，检测周期较长，且灵敏度、特异度较低[5]；同时一次检测完成样品项数较少，无法应对市场迅速、准确检验方式的需求，但这种检测方式具有直观、稳定性佳、假阳性率低等优点。国标法实施常规生化鉴定方式对食物中志贺菌进行检测，整个检测过程需4～5d。相关报道显示，经过对SS、Mac、HE 以及MT 培养基进行对比，结果得出，SS 培养基对食物中志贺菌检出率比较高，为降低漏检、误诊等发生率，可同时使用Mac 培养基进行检测，以提升检测准确性与检出率。

1.2 快速生物检测仪器法

微生物自动化检测具有操作简便、便捷、准确性高等优点，是微生物检测发展方向之一。国内外已有多种全自动微生物分析系统问世[6]。例如Autoseptor 系统、Sensititre 系统、vitek一Ams 系统、Vitek 系统以及Midd 系统。其中法国生物梅里埃公司的Vitek-Ams 系统是众多全自动微生物分析系统里唯一被美国分析化学家协会（AOAC）定为的标准方式，此系统是以每种细菌的微量生化反应为基础，仪器定时自动检测微量培养基的发酵情况，计算机依据接收的发酵资料实施换算，并与数据库所得检验结果实施对比[7]。

1.3 免疫学检测技术

随着免疫学逐渐完善，以最初凝聚试验、沉淀试验以及补体结合试验等免疫学检验方式，到先进酶联免疫吸附法、免疫印迹等方式，为迅速检验志贺菌提供了新的检测技术。

1.3.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（ELISA）主要是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应以及酶对底物的高效催化作用相结合的一种的敏感性较高试验技术。相关研究显示，ELISA 具有较高的敏感性以及特异性，所有可溶性的抗体抗原反应系统均可检测，最小检测值可达至微克水平[8]。该检测方式与放射免疫方式对比，ELISA 的标记试剂较为稳定，同时无放射性损伤[9]。

1.3.2 免疫印迹

免疫印迹又可称之为蛋白质印迹，其是一种利用特异性抗体鉴定抗原方式，使用免疫印迹方式检测无需采取特殊设备，且操作简便、检测准确性较高。相关研究显示，使用IPaC 蛋白单克隆抗体免疫印迹方法检测大便样品中的大肠埃希菌与志贺菌，结果显示，其与PCR 方式检测IPaC 蛋白基因结果相一致[10]。

1.4 分子生物学检测技术

以分子生物学为基础建立的众多检验技术，以其迅速、准确以及高特异性等优点成为生物技术革命的新产物，已广泛应用于食源性致病菌的检测中。随着微生物学、分子生物学以及生物化学等迅猛发展，对病原微生物鉴定已不再局限于对其形态结构与生理特性等实施检验，以此从分子生物学水平上对生物大分子进行研究，尤其是在核酸结构与其组成部分。在此基础上建立多种检验技术。其中包括聚合酶链反应（PCR）技术、基因芯片等，逐渐应用于食源性病原菌的迅速检验中。

1.4.1 常规聚合酶链式反应（PCR）

常规PCR 主要采取琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检查结果，其结果主要经过目测有无扩增条带实施判断，因此存在一定的主观性。常规PCR 需明确待扩增目的片段的序列，依据此序列设计一对应引物。相关报道显示，将志贺菌ipaH 基因序列作为靶目标，设计一对引物（5’GTTCCTTGACCGC-CTTTCCGATAC-3’与5’GCCGGTCAGCCACCCTA-3’），扩增产物为700bp，其对临床上疑似菌痢的粪便标本实施检测，并以PCR 为金标准，培养法敏感性、特异性分别为72%与100%[11]。

1.4.2 RT-PCR

RT-PCR 技术主要是在PCR 反应体系中加入荧光基团，选用荧光信号对PCR 整个进程实时检测，随后经过标准曲线定量分析未知模板[12]。熊辉[13]研究显示，对2700 份肛拭子样本使用双色RT-PCR 法检测志贺菌，结果显示，双色RT-PCR 检出率0.11%高于培养法0.00%。尽管RT-PCR 检测成本较高于荧光探针保持时间较短，但在线式采取检测荧光信号强弱改变，可有效避免常规PCR 受多因素干扰影响。

1.4.3 质粒图谱分析

质粒图谱主要是经过分析细菌中所携带的质粒分子量，以及其在电泳道上形成图谱特点鉴定细菌的技术。因同源性菌株所携带的质粒相似，故常采取检测质粒图谱的方式分析细菌来源及其某些遗传性状。质粒图谱分析方式是一种简便、迅速以及可靠的检测方式，故使用此种方式对志贺菌实施分子流行病学研究，有利于追踪传染源与掌握流行株的耐药情况，以此为临床治疗、菌痢的检测提供有效的理论依据[14]。

1.4.4 核糖体分型

核糖体16S rRNA 分型也是制定志贺菌亚型的分子生物学方式，其主要是借助限制性内切酶将核糖体16S rRNA 核酸序列裂解为若干片段，使用电泳方式对片段进行分离，同时将不同来源菌株进行结果对比，对不同菌株间变异特点进行分析，以此为流行病学提供有效的理论依据。但核糖体分型在检测志贺菌中效果并不佳，此种方式分型效力与质粒图谱不同，多种不同来源的志贺菌使用质粒图谱可分为若干型别，但使用核糖分型却无法显示出[15]。

1.4.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

PFGE 是目前实施志贺菌流行病学分析最常用方式之一，其主要是借助限制性内切酶识别核酸序列上的特异位点，其将整个细菌染色体组裂解分为若干片段，经过脉冲场电泳分离成像，通过不同图型间对比，以此对同一菌种亚型的不同菌株来源及其特点进行分析。雷高鹏[16]研究显示，对30 株宋内志贺菌实施PFGE 分型分析，结果显示，2007-2017 年四川省腹泻病例宋内志贺菌分离株PFGE 优势带型明显，且部分带型存在聚集。病原菌基因片段位置与大小表现存在多态性，对志贺菌分离株之间的同源性、传染源追溯、疫情预测、防治措施提供有效的理论依据。

1.4.6 基因探针杂交与基因蕊片

基因探针是使用人工合成的方式从微生物中制备相应的DNA 片段，进行纯化后标记上同位素、荧光物质以及生物等，进而制成特异性DNA 探针，经过对待测样本、标志性DNA 探针之间能否形成杂交分子进行检测，以此对样品中是否存在目标微生物进行评估。但极易引起假阳性，不利于应急处理的迅速检测。而基因芯片主要是使用原位合成或显微打印方式，将数以万计的DNA 探针固化在支持物表面，以此产生二维DNA 探针阵列，与标志的物品实施杂交，经过检测杂交信号来实现对生物样品迅速、并行以及高效检测或医学诊断。基因芯片技术具有一定的敏感性高、特异性强以及操作简便等优点，其在肠道致病菌检测中具有较大的应用价值。

2.小结

目前针对食品中志贺菌的检测方式，主要包括常规生化检测、快速生物检测仪器法、免疫检测法、分子生物学方式等，上述的检测方式均有其各自优缺点，其中ELISA 在检测食品中志贺菌中具有操作简便、迅速以及准确性高等优点，并已在临床中广泛应用。因此在检验食品中志贺菌中，应充分掌握各种检测技术的应用范围、局限性等，同时结合实际情况，不断完善、改进食品中志贺菌检测方式。同时还需建立、健全食品法律法规，以增强食品安全监控，以提升检测技术，促使食品快速检测技术达到国际先进水平。