污泥和生长素添加对草地早熟禾生长及土壤微生物的影响

曹允馨，张宁，常智慧

(北京林业大学草业与草原学院，北京 100083)

污泥是污水处理厂净化处理污水时产生的不包括栅渣、浮渣和沉砂池沙砾的废弃物[1]。污泥不仅可以提高植物氮素和水分利用效率，促进其在干旱条件下的生长[2-4]，而且可以提高土壤的生物和化学性质，促进土壤微生物的活性[5-7]，增加土壤中细菌和放线菌的数量[8-9]。

污泥中富含多种生物活性物质[10-11]，这是污泥对微生物产生影响的原因，如含有作为酶促底物的有机碳、有机氮[12-13]等可以促进土壤微生物生长和分泌各种酶[14]。研究表明施入污泥可以提高土壤酶活性[15]；污泥复混肥可以增加硝化细菌和好气性纤维素分解细菌数量，提高放线菌和氨化细菌的活性[16]。此外污泥堆肥也可以显著提高微生物量碳氮和土壤微生物量[12,17]，增加土壤中一些酶如脲酶、过氧化氢酶等的含量，从而改善土壤结构[18-20]。

微生物以污泥中的生物活性物质为基质，可以产生并向土壤中释放激素[21]。许多独立生长的微生物都可以合成植物激素，如生长素、赤霉素、类激动素物质等[22]。因此，污泥可以通过影响微生物，间接影响植物生长。吲哚-3乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)是天然植物生长素的主要活性成分[23]。近年来发现的与生长素合成相关的重要催化酶系和克隆的关键调控基因多数通过依赖色氨酸(Trp-dependent pathway)合成途径合成[24]。此外，在植物体内还存在其他生长素，如吲哚丁酸(indole-3-bu- tyric acid,IBA)和4-氯吲哚-3-乙酸(4-chloroindole- 3-acetie acid,4-CI-IAA)等[25]。有研究表明，吲哚乙酸与吲哚丁酸的生理功能相似，但吲哚乙酸在植物体外易降解。与吲哚乙酸相比，吲哚丁酸不易被光分解，比较稳定[22,24]。

草地早熟禾(Poapratensis)是一种优质的冷季型草坪草，适应性广、绿期长，坪质优美，是我国北方地区常用的建坪草种[26]。但草地早熟禾具有生长缓慢、抗旱性不强的特性，影响其坪用质量和效率[27]。本试验用硝酸铵与污泥提供等量氮素，研究干旱胁迫下污泥和生长素对草地早熟禾生长和土壤微生物的影响，观察草地早熟禾的耐旱性，探究污泥提高草地早熟禾抗旱性的机理。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用草种是草地早熟禾品种午夜，播种量为15 g/m2；基质是煅烧黏土(profile products，Chicago)，经800℃高温煅烧，不含任何营养物质；污泥取自北京某污水处理厂，其含水量为84.7%，pH值为5.36，全氮含量66.6 mg/g，磷含量68.9 mg/g，钾含量13.3 mg/g，有机质含量72.6%，腐殖酸含量40.0%。试验所用氮肥是硝酸铵溶液与污泥，除氮素外的营养物质由无氮霍格兰营养液提供。

1.2 污泥中草地早熟禾可利用的有效氮含量测定

试验处理分为施用污泥和不施用污泥两类，为保证所有处理能为草地早熟禾提供等量的有效氮素，需要用几个梯度浓度的硝酸铵溶液和一定量的污泥处理草地早熟禾以测定污泥中的有效氮含量。

试验在光照培养箱中进行，日/夜温度为24℃/18℃，光照14 h，光强600 μmol/(m2·s)。采用直径16 cm，深10 cm 的聚乙烯塑料盆，每盆装0.7 kg 煅烧黏土。播种前浇水，使每盆的土壤含水量达到90%田间持水量。

试验采用随机区组设计，设6个处理：1)对照；2)25 mg/kg氮素；3)50 mg/kg氮素；4)75 mg/kg氮素；5)15 g未添加色氨酸的污泥(UB)；6)15 g添加20 μmol/g色氨酸的污泥(TB)。每个处理5次重复。前4个处理利用8 mg/mL 硝酸铵溶液提供氮素(具体添加量根据土重进行换算)，后两个处理利用污泥提供氮素，硝酸铵溶液分别在播种前、播种15 d、播种30 d 分3次等量加入，污泥在播种前用水调成匀浆加入基质中，混合均匀。

试验持续8周，全程保持充足的浇水，所有处理用无氮霍格兰溶液提供除氮素外的其他营养物质。定期修剪，保持草坪草高度为8～10 cm，将每次修剪所得的草屑收集，烘干保存。试验结束后，将所有地上部分全部收集烘干，与之前收集的样品合并，采用凯氏定氮法[28]测定各处理草坪草的全氮含量。

利用前4个处理的数据作出氮摄入量Y(mg/盆)和氮施用量X(mg/kg)的标准曲线，并得出线性方程：Y= 0.339 6X+7.058 2(R2=0.942 3)。通过方程计算出未添加色氨酸的污泥的有效氮含量为2.339 mg/g，添加色氨酸的污泥的有效氮含量为2.577 mg/g。而后的试验中要施用75 mg/kg氮素所需的UB、TB添加量分别为：19.87 g/kg和18.03 g/kg。

1.3 试验条件

试验在北京林业大学气象站温室进行，日夜温度约为29℃/17℃，光照时间为13 h，光照强度约600 μmol/(m2·s)。

1.4 试验设计

采用裂区设计，主处理为水分条件，包括：(1)充分浇水：土壤水分含量保持在90%田间持水量；(2)干旱处理：不浇水，草坪自然干旱，待土壤水分含量降至25%田间持水量时复水，保持90%田间持水量一周。副处理有5个：(1)对照CK；(2)吲哚丁酸处理IBA(2 μmol/L)；(3)未加色氨酸的污泥处理UB(19.87 g/kg)；(4)添加色氨酸的污泥处理TB(18.03 g/kg)；(5)色氨酸处理TRP(360.6 μmol/kg)，每处理4个重复。IBA 的施用量经计算后是0.365 mg/盆(相当于70%田间持水量时浓度为2 μmol/L 的IBA)。色氨酸的用量与TB 处理中的色氨酸含量相等。所有处理的氮施入量为75 mg/kg。污泥在播种前用水调成匀浆均匀混入基质中，IBA、TRP 配成溶液，播种前均匀混入基质中，硝酸铵溶液分别在播种前、播种15 d、播种30 d 分3次等量加入。2016年4月20日播种，在25 cm×25 cm的方形塑料花盆中装入2.5 kg煅烧黏土，浇透水静置一段时间后，土表与盆沿距离不超过1 cm为宜。播种前及整个生长期内保持充足的浇水，土壤含水量达到90%田间持水量。

取样时间分别为：干旱处理组土壤水分含量分别为田间持水量的90%、50%、30%、25%和90%(复水一周后)时，具体时间为7月7日、7月14日、8月3日、8月11日和8月19日。

1.5 测定指标及方法

草坪坪观质量参考杨燕等[29]的方法，9分制，依据草坪颜色、均一度、盖度等方面打分，1代表草坪完全死亡，9代表草坪颜色浓绿、稠密、均一，有茂盛的地上茎叶，6代表可接受的最低草坪质量水平[3]；目测草坪叶片测定叶片萎蔫度，从0到100%，0代表叶冠完全，100%代表永久萎蔫；相对含水量采用饱和称重法[4]。使用Li-6400 光合仪测定草地早熟禾叶片光合速率。微生物总量采用改良后的氯仿熏蒸浸提法[30]测定。土壤微生物群落结构在干旱处理开始前(7月7日)，取干旱胁迫组的各处理的土壤样品(每个处理3个重复)，送至美吉生物公司做16S rRNA 测序，以测定干旱胁迫开始前不同处理的土壤微生物多样性。

1.6 数据分析

使用Microsoft Excel 2007 软件整理原始数据、绘制图表，用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 污泥和生长素对干旱胁迫下的草地早熟禾生长的影响

2.1.1 坪观质量 充分浇水条件下，各处理的坪观质量基本没有显著变化，整体来看，两种污泥处理的坪观质量高于对照(表1)，污泥处理可以显著提高草地早熟禾的坪观质量。干旱处理情况下，各处理的坪观质量随土壤含水量的下降而下降，复水一周后显著恢复。干旱期间，IBA处理与空白对照的坪观质量无显著差异，TRP、UB和TB 处理可以显著降低干旱对草地早熟禾坪观质量的损伤。

表1 2种水分条件下草地早熟禾的坪观质量

2.1.2 叶片相对含水量 充分浇水条件下，纯污泥处理的叶片相对含水量在试验过程中无显著变化，CK、IBA、TB和TRP处理均在8月3日显著上升，之后无显著变化(表2)。 单独施用IBA和TRP只能在试验前期提高草地早熟禾的叶片相对含水量，而施用两种污泥能显著提高草地早熟禾叶片的相对含水量(P<0.05)。

表2 2种水分条件下草地早熟禾叶片的相对含水量

干旱胁迫条件下，各处理叶片相对含水量均从胁迫之初开始一直显著下降，复水一周后显著回升。干旱处理期间，4个处理的叶片相对含水量均显著高于对照(P<0.05)，IBA、UB、TB和TRP处理都能在干旱胁迫下减缓草地早熟禾叶片相对含水量的下降，UB、TB 和TRP 对叶片相对含水量的影响比IBA 处理更显著。

2.1.3 叶片萎蔫度 充分浇水条件下的各处理叶片萎蔫度无显著变化。干旱胁迫下，各处理的叶片萎蔫度都随着土壤水分含量的下降而显著上升，复水后显著下降(表3)。干旱处理期间，IBA、UB、TB 和TRP处理的叶片萎蔫度都显著低于对照(P<0.05)。复水一周后，对照组的叶片萎蔫度仍然显著高于其他处理(P<0.05)。说明，IBA、UB、TB 和TRP 处理均能在干旱胁迫下缓减草地早熟禾的萎蔫，且在复水后可以加快草坪草的恢复速度。

表3 干旱胁迫下草地早熟禾叶片的萎蔫度

2.1.4 光合速率 充分浇水条件下，各处理的光合速率在试验过程中均无明显变化(表4)，污泥处理和激素处理都可以显著提高草地早熟禾的光合速率。试验后期，UB、TB 和TRP 处理的光合速率显著高于IBA(P<0.05)，说明在试验后期，UB、TB 和TRP 对草地早熟禾的光合速率的影响比IBA 处理更显著。

表4 2种水分条件下草地早熟禾叶片的光合速率

干旱胁迫下，所有处理的光合速率均随着土壤水分含量的下降而降低，在8月11日达到最低，8月19日(复水一周后)有所回升。与对照相比，TRP、UB 和TB 处理能显著提高干旱胁迫下草地早熟禾的光合速率，IBA也可以提高其光合速率，但差异不显著，总体上污泥处理的影响比激素处理更显著。

2.2 污泥和生长素对干旱胁迫下的草地早熟禾土壤微生物的影响

2.2.1 土壤微生物量碳 充分浇水条件下，处理间微生物量碳的关系为UB、TB>IBA、TRP>CK，IBA、TRP、UB和TB处理在充分浇水条件下都能够提高土壤微生物量碳，但污泥处理的影响比激素处理更显著。

干旱处理下，各处理的土壤微生物总量均在8月11日(土壤水分含量降至25%田间持水量)显著下降(P<0.05)，又在复水一周后显著回升，且与对照差异显著(P<0.05)。在干旱胁迫下，IBA和TRP处理均能显著提高土壤微生物量碳，UB和TB处理也能显著提高土壤微生物量碳的含量，且效果明显优于IBA和TRP处理。

2.2.2 土壤微生物生物多样性 稀释性曲线[31]用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也用来说明样本的测序数据量是否合理。

Shannon-Wiener反映样本中微生物多样性的指数[32]，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。由图1和图2可知，本试验的数据量是合理的。

表5 2种水分条件下草地早熟禾土壤的微生物量碳

图1 稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve

图2 Shannon-Wiener 曲线Fig.2 Shannon-Wiener curve

此外，Shannon指数越高代表生物多样性越高。充分浇水条件下，UB 处理的土壤微生物多样性显著高于CK、IBA 和TRP 处理(P<0.05)，CK 显著高于IBA和TR 处理(P<0.05)，UB 和TB处理间无显著差异(图3)。

图3 污泥和生长素处理下草地早熟禾土壤微生物多样性Fig.3 Effects of biosolids and auxin on soil microbial diversity of Kentucky bluegrass

2.2.3 土壤微生物种群结构 Venn 图[33]用于统计多个样本中所共有和独有的OTU 数目，即菌种数目。大部分的菌种是所有处理及对照所共有的，此外每个处理还有一定数量的特有的菌种，其中两种污泥处理所特有的菌种最多，远高于其他处理，而两种激素处理所特有的菌种低于对照(图4)。由此表明添加污泥(UB 和TB)能够提高水分充足条件土壤微生物的丰度。

图4 污泥和生长素处理下草地早熟禾土壤微生物丰度Fig.4 Effects of biosolids and auxin on soil microbial abundance of Kentucky bluegrass

LEfSe[34]分析结果中，从内到外的5个圆圈分别代表门、纲、目、科、属5个分类学水平，每个圆圈上的彩色点代表在该分类水平上该颜色所代表的处理组中的对样本划分具有显著差异影响的类群。图5中，紫色、蓝色、绿色和红色分别代表TB、UB、IBA 处理和CK。由图可以看出，紫色所覆盖的范围远大于蓝色，蓝色覆盖的范围大于红色和绿色，这说明TB 和UB 处理的土壤微生物丰度明显高于CK 和IBA 处理。已知类芽孢杆菌属(Paenibacillus)中的一些菌种能够刺激植物的生长[35]，通过对每个处理的单样本多级生物组成分析，可以找出各处理的土壤中类芽孢杆菌的含量百分比，如图6，TB 处理中的类芽孢杆菌含量显著高于CK 和TRP 处理(P<0.05)，IBA 和UB 处理的类芽孢杆菌含量高于CK，低于TB 处理，但差异不显著。

图5 污泥和生长素对草地早熟禾土壤微生物丰度(显著差异物种)的影响-Lefse 分析Fig.5 Effects of biosolids and auxin on soil microbial abundance(significantly different species)of Kentucky bluegrass using Lefse analysis

图6 污泥和生长素处理下土壤中类芽孢杆菌含量Fig.6 Effects of biosolids and auxin on the abundance of Paenibacillus in soil

PCoA[32]是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，Unifrac PCoA 基于进化距离，在进化水平上挖掘影响样品群落组成差异的潜在主成分。PC1 和PC2 代表对于两组样本微生物组成发生偏移的疑似影响因素，PC1的值为43.96%，表示X 轴的差异结果可以解释全面分析结果的43.96%，PC2的值为14.03%，表示Y 轴的差异结果可以解释全面分析结果的14.03%(图7)。

CK 与其他处理的微生物群落结构均存在差异，UB 和TB 处理的差异较小，IBA 与TRP 处理的差异较小，但可能UB 和TB 与CK 的差异较IBA 与TRP 的差异更大(图7)。

图7 污泥和生长素处理下草地早熟禾土壤微生物群落结构Fig.7 Effects of biosolids and auxin on the structure of soil microbial community in Kentucky bluegrass

2.3 土壤中特征微生物

Heatmap[36]直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。

根据图8中的色块可以找出一些细菌如小单孢菌属(Micromonospora)、链霉菌属(Streptomyces)和红球菌属(Rhodococcus)等，在添加污泥的处理(UB 和TB)与未添加污泥的处理(IBA、TRP 和CK)中的含量相差很明显，对上述3个菌种在样品中的数量进行比较(表6)，UB 和TB 处理中的小单孢菌和链霉菌细菌数量均显著高于CK、IBA 和TRP 处理(P<0.05)，UB 处理中的红球菌数量显著高于其他处理(P<0.05)。

图8 污泥和生长素对草地早熟禾土壤微生物群落结构的影响-Heatmap 图Fig.8 Heatmap showing the effects of biosolids and auxin on soil microbial community structure of Kentucky bluegrass

表6 草地早熟禾土壤中几种微生物的含量

3 讨论

3.1 污泥对干旱条件下草地早熟禾的生长及抗旱性的影响

施用污泥能在干旱胁迫下显著降低草坪草坪观质量和叶片萎蔫度，有效缓解光合速率、叶片相对含水量的下降，使草地早熟禾在干旱胁迫下仍能维持较高的生长势。研究表明，施用污泥能够提高高羊茅的坪观质量、叶片相对含水量和叶绿素含量[2]，加快干旱胁迫复水后坪观质量的恢复速率，在干旱胁迫下，污泥与无机肥料混合施用比单独施用污泥更利于减缓干旱对坪观质量造成的损伤[3]。在本试验中，干旱胁迫下，UB、TB和TRP处理可以减缓坪观质量的下降，UB和TB比TRP对改善草地早熟禾的坪观质量有更显著的影响，与前人研究结果一致。UB和TB处理在水分充足或是干旱胁迫下都可以提高草地早熟禾的光合速率，Zhang等[9]的研究表明污泥能够提高高羊茅的光合速率，与本试验研究结果一致。

本试验中，在两种水分条件下，4种处理对草地早熟禾叶片相对含水量均有显著提高的效果，且UB和TB处理的表现优于IBA和TRP处理。干旱胁迫下，UB、TB和TRP处理均能减轻草地早熟禾叶片的萎蔫程度，干旱结束复水后，IBA、TRP、UB和TB处理还能加快草坪草的恢复，韩朝等[2]的研究也表明污泥能够在重度干旱胁迫下降低高羊茅的叶片萎蔫度，与本试验的结果一致。

3.2 污泥和生长素对土壤微生物数量和种群结构的影响

添加污泥能够显著提高土壤微生物量碳，增加微生物群落多样性。本试验中，UB和TB处理能够显著增加草地早熟禾土壤中的微生物量碳，且比IBA和TRP处理对其提高的幅度更大，在微生物群落结构的分析中也显示，UB和TB处理的土壤微生物多样性、微生物丰度明显优于对照，在群落结构上与CK存在一定的差异。已有的研究表明污泥的施用能够增加土壤微生物量碳，提高土壤微生物活性、增加土壤微生物群落功能多样性指数，这与本试验结果一致[37-39]。

有研究表明，施用污泥堆肥一段时间后可，土壤中的绿弯菌门(Chloroflexi)细菌成为优势菌[40]，这种菌是丝状菌，可以降解大分子有机物[41-42]，本试验中，通过对单样本多级物种组成的分析可知UB、TB和TRP处理均提高了土壤中绿弯菌门的数量。所以污泥中的丰富的营养物质可能会为微生物创造更适宜的条件而增加其总量与多样性。超过80%从根际分离的细菌都可以合成IAA[43-44]。所以微生物量碳及群落结构的多样性提高可能意味着为植物提供生长素的能力提高。

4 结论

试验以污泥和生长素为主要影响因素，探究干旱胁迫下，污泥对草地早熟禾生长和土壤微生物的影响，旨在从植物生长和微生物层面，找到污泥提高草地早熟禾耐旱性的原因。污泥提高草地早熟禾的抗性可能是改变了土壤中微生物的数量和种类，促进了土壤微生物的生长，提高了土壤酶活性和生长素水平，改善了土壤结构，从而促进了草地早熟禾的生长代谢。在污泥中加入色氨酸比单独施用污泥或色氨酸对草坪草的耐旱性能产生更显著的影响，说明污泥提高微生物多样性的效应与增加生长素前体色氨酸含量的效应叠加，可以为草坪草提供更多的激素营养，以促进其生长并改善耐旱性。这为生物污泥的再利用提供了新的思路。