苦参开花和授粉生物学特性的研究△

申国安，吴尚英，王玉龙，郭宝林*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.山西振东道地药材开发有限公司，山西 长治 047100；3.山西省长治市上党区农业农村局，山西 长治 047100

苦参Sophora flavescensAit.为豆科槐属植物，根部入药，性苦，味寒，归大肠、膀胱经，具有燥湿清热、止痒杀虫、利尿的功效，用于治疗血痢、便血、黄疸、浮肿、小便不利、疥癞、湿疮、瘙痒等[1]。苦参含有丰富的次生代谢产物，包括生物碱、黄酮类等。其中，苦参生物碱具有抗虫、抗病毒、抗菌、抗肝损伤、抗肿瘤、抗胃黏膜损伤、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗炎、利胆、治疗组织细胞增生和纤维化等作用[2-4]。苦参还被广泛用于提取制造生物农药[1,5]，市场需求量很大。但是因为其野生资源枯竭，现在主要通过人工栽培生产。

苦参是多年生豆科植物，可以通过地下茎无性繁殖，但繁殖系数较低。对于大规模栽培生产，种子繁殖是最好的方式。豆科植物授粉繁殖方式差异很大，其中部分具有典型的闭花授粉特性，在花朵尚未开放时已经基本完成了授粉，如大豆[6]；还有部分豆科植物自交不亲和，必须异花授粉，如紫花苜蓿[7]。目前，苦参的开花习性和授粉行为等生殖性状尚缺乏系统的研究。通过前期调查发现，苦参具有典型的闭花授粉特征，也存在异花授粉的特征。这些研究结果为苦参种质的保存、种子的生产和新品种培育提供了参考。

1 材料

1.1 样品

研究所用苦参品种为“振苦1 号”，种植于山西沁县西安庄苦参繁殖基地。基地位于晋东南地区，处于太行、太岳两山之间，E112°41′，N36°45′，属黄土丘陵山区，平均海拔1000 m，土壤主要为褐土。该地区属温带半湿润大陆性季风气候，无霜期170 d，年平均日照时数2474 h，年平均气温8.9 ℃，年平均降雨量600 mm，相对湿度60%。实验期间种植基地日间平均温度和湿度分别为26 ℃和65%，夜晚平均温度和湿度为17 ℃和76%。植株经中国医学科学院药用植物研究所郭宝林研究员鉴定为苦参Sophora flavescensAit.。

1.2 仪器

HT-400B 型恒温箱（上海赫田科学仪器有限公司）；CX43型生物显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司］；PXS-A 型解剖镜（上海普丹光学仪器有限公司）。

1.3 试药

蔗糖（批号：DH326-1，北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；联苯胺（批号：B804016-100mg，上海麦克林生化科技有限公司）；过氧化氢［批号：H1009，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］。

2 方法

2.1 花粉萌发力实验

分别配制5%、10%、15%的蔗糖溶液。选取刚刚开放的苦参花朵用于观察。在载玻片上加1 滴培养液，在培养液上方轻轻振动花药，使花粉散布于培养液上。将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25 ℃黑暗恒温箱中5 h。显微镜观察花粉萌发情况，每个样品随机选取3 个视野统计萌发率。以花粉管长度超过花粉直径2倍为正常萌发[8]。

2.2 柱头可授性实验

用联苯胺-过氧化氢法对柱头可授性进行测定[9]。联苯胺-过氧化氢反应液按照1%联苯胺-3%过氧化氢-水（4∶11∶22）进行配制，现配现用。去掉外面的部分花瓣，露出柱头。将柱头浸入联苯胺-过氧化氢溶液，放置1 min，在解剖镜下进行观察。如果柱头具有可授性，将在柱头周围出现大量的气泡，附近的溶液变为蓝色。

3 结果

3.1 苦参小花发育阶段的划分

苦参是多年生草本植物，地上部茎叶在冬季枯死。第二年春天从地下茎萌发出新芽，长出新的枝条。每个枝条在接近顶部会产生2～4 个小分枝，花序着生在每个分枝顶端。主花序首先开放，花期6—8 月。苦参为总状花序，通常29～35朵小花。花序基部的小花最早发育，小花自下而上依次开放。每朵小花开放2～3 d。苦参为典型的蝶状花，包括旗瓣、龙骨瓣、翼瓣、10 枚雄穗和花柱。随着苦参小花发育成熟，花朵逐渐变大，同时雄蕊和雌蕊呈现非常显著的形态和生理变化（图1）。花柱在发育成熟的时候，柱头出现黏液，有助于黏附花粉粒，促进花粉的萌发。雄蕊在发育成熟的时候，花药发生破裂，释放花粉。根据苦参花器官的外观大小和雌雄蕊的发育程度，本研究把苦参小花的发育过程大致分为7 个阶段（表1）。S1 阶段小花体积较小，花瓣长5 mm左右，花瓣呈现浅绿色，完全被绿色的萼片包裹，柱头没有黏液；S2 阶段小花体积有明显增大，花瓣微微露白，长约6.8 mm，柱头已经迅速发育，柱头开始出现黏液，但是检测不到花粉；S3阶段小花仍然闭合，体积继续明显增加，柱头上检测不到花粉，S2阶段和S3阶段柱头都有黏液，但是还没有花粉出现在柱头上；S4 阶段小花仍然闭合，体积增大明显，柱头上开始能检测到花粉，说明已经有花药成熟，开始释放；S5 阶段小花继续发育长大，旗瓣没有打开，柱头上有花粉，说明花瓣在没有打开之前，花药已经成熟并部分释放；S6 阶段，旗瓣张开明显，从外部可以看到花药，花药已经破裂，花粉大量释放。此时，花瓣刚刚张开不久，花粉活力最高；S7 阶段，旗瓣展开，花瓣和花萼之间形成明显空隙，花药完全枯萎，但是柱头继续伸长。

表1 苦参小花不同发育阶段的形态和生理特征（,n=10）

表1 苦参小花不同发育阶段的形态和生理特征（,n=10）

图1 苦参小花发育不同阶段的典型特征

对花器官发育的观察结果表明，小花在开放之前，花粉已经成熟，开始释放。在小花完全开放之后，花粉迅速失活，但是柱头继续伸长，意味着苦参存在异花授粉的可能。异花授粉能够增加群体的遗传多样性，增强对环境的适应性。

3.2 苦参小花不同发育阶段花粉活力与柱头可授性

在对苦参小花的形态特征进行研究后，把苦参花器官的发育分为7 个阶段。进一步，对每个发育阶段的花粉和柱头活力进行了分析（表2、图2）。花粉在S3 阶段开始具有活力，但是没有在柱头上观察到花粉，说明此时花粉只是部分发育成熟，花药还没有开裂，但是在花粉释放之前，已经部分具有活力。在S4、S5 阶段，花粉活力急剧增加，在柱头上也观察到了花粉粒，说明花药开始部分释放。在S6阶段，花粉活力达到最高，此时花朵已经开放。

图2 不同发育阶段花粉活力和柱头活性变化规律（,n=3）

表2 不同发育阶段花粉活力和柱头可授性分析（,n=3）

表2 不同发育阶段花粉活力和柱头可授性分析（,n=3）

注：+表示柱头具有可授性；-表示柱头没有可授性。

以上结果表明，花粉和柱头的生理活性跟花器官的外部形态特征具有相关性，将苦参花器官的发育划分为7 个阶段是合适的。当花瓣长11.5～11.8 mm，花粉活力最强，此时是授粉的最佳时期。在S7阶段，小花旗瓣松动，可以看到花药呈现褐色，花粉活力急剧下降。柱头的发育速度比花药要慢，有滞后现象。在S5 阶段，当花瓣长度＞11.5 mm，花瓣仍然处于闭合状态，但柱头已具有可授性。此时，花粉活性已经较高，可观察到花粉释放，柱头上粘有花粉。但在S7 阶段，花粉活力几乎完全丧失，柱头仍然有活性，意味着柱头有能力接收外源的花粉。

3.3 开花后苦参花粉活性的变化

植物开花以后，花粉的活力会迅速降低，失活的速度因植物而异。花粉存活的时间越长，其能被风和昆虫携带的越远，越可能实现异花授粉。分别使用5%、10%、15%的蔗糖溶液进行测试，结果显示，使用10%蔗糖溶液，苦参花粉萌发效果最佳，适合用于花粉萌发实验，这与多数植物中的实验结果一致[10]。因此，选用10%的蔗糖溶液对花粉在各种条件下的活力进行了测试，结果如表3 所示，在室温（约25 ℃）下，苦参花粉活力在开花后12 h仍然保持在80%以上；12 h 后，花粉活力下降明显。超过72 h，活力为原来的30%左右，此后花粉活力急剧降低，几乎全部丧失。结果说明，开花当天苦参花粉的活性最好，但是在72 h 之内仍然能保持一定活力，意味着苦参花粉有机会被传播得很远。如果进行人工授粉，最好在12 h之内使用花粉。

表3 苦参开花后不同时间不同温度下的花粉活力（,n=3） %

表3 苦参开花后不同时间不同温度下的花粉活力（,n=3） %

注：*P＜0.05。

花粉的存活时间跟温度有一定的关系，在低温情况下，活力保持时间更长[11-12]。在4 ℃下，苦参花粉失活速度显著降低，在96 h后，仍有28.89%花粉具有萌发能力。因此，在育种实践中，可以把花粉放在4 ℃保存，适当延长花粉的活性，解决花期不遇的问题。

3.4 苦参柱头可授性的日间变化

植物柱头活力在1 d中会有一定的变化，多数植物的柱头活力在上午较高。检测1 d中柱头活力最高的时间段，可以帮助确定最佳的人工授粉时间，对杂交育种具有重要的指导意义。选用苦参处于S6 阶段的小花，用于观察柱头可授性在1 d的变化，结果发现，在7：00—9：00，柱头可授性最强，9：00之后，柱头可授性下降，13：00 之后，柱头失去可授性，但在19：00 柱头的可授性得到一定恢复。这些结果说明，苦参柱头上午活力强，因此人工杂交授粉最好在9：00 之前进行。苦参柱头活性在傍晚有所恢复，可能是受到内在的生物节律调控，也可能是因为柱头可授性受到外部环境因素影响，与温度、湿度有一定关系。中午温度高、湿度低，导致柱头活性降低，这一点需要未来继续深入研究。

4 讨论

研究植物的生殖特性，特别是花发育的过程，对育种实践和理论研究具有重要的指导意义。豆科植物的花发育具有独特性[13-15]，但是苦参的花发育研究较少。本研究把苦参的小花发育分为7 个时期，不仅参考了小花发育的外观特征变化，还考虑了花粉的活性和柱头的授粉能力，能够反映花器官形态和生理特征的重要转变阶段，为深入研究苦参的传粉和生殖发育提供了参考。这种划分与其他豆科植物上的研究结果类似，如根据大豆花朵由幼蕾至花冠开放的特征将其划分为9个时期[16]。

花的发育主要涉及雌雄生殖器官的发育。苦参雄蕊的发育很快，在花朵完全开放之前，已经发育成熟，花粉具有授粉的活力。虽然雌蕊发育滞后于雄蕊的发育，但是在花朵没有开放之前，花柱已经成熟并出现黏液，具有了可授性。尤其是在花朵开放之前，花粉已经破裂释放，柱头上可以观察到黏附有花粉粒，说明苦参呈现出典型的闭花授粉行为。因为在开花之前授粉已经进行，所以在做杂交育种的时候，去雄操作应该在小花发育的S3、S4 阶段之间进行。如果去雄太晚，雄蕊破裂，花粉大量释放，可能已经完成授粉。柱头的活力在上午9:00 之前最强，所以去雄和授粉以上午为最好。柱头的活力可以持续很长时间，所以人工授粉可以在去雄之后连续3 d 多次进行，增加授粉成功几率。