碘克沙醇注射液细菌内毒素检查法质量标准修订建议

范治云，刘 瑞，赵 岩，肖 英，祝清芬

（山东省食品药品检验研究院·国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室，山东 济南 250101）

碘克沙醇注射液属X线对比剂，目前国内外几个厂家执行的细菌内毒素检查法质量标准（YBH03522014，YBH01492018，YBH06512010，JX20190104）均有差异，如扬子江药业集团有限公司、南京正大天晴制药有限公司、江苏恒瑞医药股份有限公司、GE Healthcare Ireland Limited的细菌内毒素限值（L）分别为0.05 EU／100 mg、0.672 EU／mL、0.16 EU／mL、0.0025／0.0021 EU／mg（270／320 mg／mL），方法分别为凝胶法、动态显色法、浊度法、显色基质法，给该品种的监督检验和质量控制带来不便。本研究中拟统一碘克沙醇注射液细菌内毒素的检查限值和检查方法，并分别用凝胶法和动态浊度法进行检查方法适用性研究，为该品种更有效的质量控制及国家标准修订提出建议。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

PKF96－4K－2296型细菌内毒素检测仪（美国ACC公司）。

1.2 试药

碘克沙醇注射液（厂家A，扬子江药业集团有限公司，批号为1908206，规格为50 mL∶13.5 g，批号为19112161和19111861，规格为50 mL∶16 g；厂家B，南京正大天晴制药有限公司，批号分别为2002261，1910241，2002271；厂家C，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号分别为191202DJ，190921DJ，191204DJ；厂家D，GE Healthcare Ireland Limited，批号分别为14749091，14891355，14895222，后3个厂家的规格均为100 mL∶32 g）。细菌内毒素检查用水（BET用水，批号为160006－201805，内毒素含量≤0.003 EU／mL），细菌内毒素工作标准品（批号为150601－201784，效价为每支80 EU），均购自中国食品药品检定研究院。鲎试剂（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批号为1906062。湛江安度斯生物有限公司，批号为1904103、规格为每支0.1 mL、灵敏度为0.06 EU／mL，批号为2001161、规格为每支0.1 mL、灵敏度为0.015 EU／mL）。动态比浊法鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号为1908210，可测内毒素范围为0.01～10 EU／mL，规格为每支1.25 mL）。

2 方法与结果［1］

2.1 细菌内毒素限值（L）确定

L＝K／M，式中，K为人每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，M为人用每千克体质量每小时最大剂量。按碘克沙醇注射液药品说明书最大剂量为150 mL（48 g碘），注射剂的K为5 EU／（kg·h），成人按60 kg计，计算M得2.5 mL／（kg·h），即碘800 mg／（kg·h），L值为0.00625 EU／mg。现有标准是企业标准上升到国家标准，而企业标准出于内控需要和安全考虑而制定的限值更严格。故根据现有国家标准，并遵照标准从严的原则，将L确定为4个厂家标准中最严格的0.0005 EU／mg。

2.2 凝胶法干扰试验

2.2.1 样品干扰预试验

目前在售鲎试剂灵敏度（λ）为0.5～0.015 EU／mL，参考文献［2］，本品内毒素有干扰情况，4个厂家各抽取1批，用BET用水将样品稀释成120，60，30 mg／mL的系列样品溶液（对应的鲎试剂λ分别为0.060，0.030，0.015 EU／mL），分别用2个厂家的鲎试剂考察上述系列浓度稀释液的干扰情况，每个浓度做2管，同时做阴性对照（NC）和标准对照，结果4个厂家的样品在30 mg／mL质量浓度下对试验均无干扰。详见表1。

2.2.2 样品干扰试验

用BET用水将细菌内毒素工作标准品制成2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ，即0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL的系列标准品溶液；并制备含有上述4种浓度细菌内毒素的质量浓度为30 mg／mL的样品稀释液，分别用2.2.1项下2个厂家的鲎试剂考察4个厂家12批样品在30 mg／mL的干扰情况，每个浓度平行4管，同时做阴性对照和标准对照。结果反应终点几何平均值为0.5λ～2.0λ，表明样品在30 mg／mL质量浓度下可消除对试验的干扰因素。详见表2。

表2 碘克沙醇注射液凝胶法细菌内毒素干扰试验结果Tab.2 Results of bacterial endotoxin interference test of Iodixanol Injection by the gel method

2.2.3 样品细菌内毒素检查

采用λ为0.015 EU／mL的鲎试剂，对4个厂家的12批样品进行细菌内毒素检查，结果均小于0.0005 EU／mg。

2.3 动态浊度法干扰试验

2.3.1 细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性分析

用BET用水将细菌内毒素标准品进行稀释，使最终细菌内毒素浓度分别为1.25，0.25，0.05，0.01 EU／mL，各取0.1 mL，分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，以细菌内毒素检测仪检测，每个浓度平行3管，结果见表3。标准曲线回归方程为lg T＝－0.31 lg C＋2.89，r＝－0.996（｜r｜应大于0.980），平行管之间的RSD均小于10%，NC反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，故细菌内毒素标准曲线成立。

表3 动态浊度法细菌内毒素平均反应时间（n＝3）Tab.3 The mean reaction time of bacterial endotoxin by KTA（n＝3）

2.3.2 干扰试验

根据标准曲线内毒素浓度的设置，选择0.25 EU／mL作为靠近曲线中点的内毒素浓度（λm），4个厂家各取1批样品，用BET用水稀释成60，30，20，15，10 mg／mL的系列样品溶液（A液），同时制备含上述样品浓度并含内毒素浓度为λm（0.25 EU／mL）的溶液（B液），分别取上述各溶液0.1 mL，加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀并测定，每个浓度平行2管。测定结束后，仪器按标准曲线回归方程自动计算出样品溶液和含标准内毒素λm的样品溶液的内毒素含量，以及该试验条件下的回收率（R）。结果表明，20 mg／mL质量浓度及以下回收率在50%～200%。详见表4。

表4 动态浊度法干扰试验结果（n＝2）Tab.4 Results of the interference test by KTA（n＝2）

2.3.3 动态浊度法样品细菌内毒素检查

取4个厂家共12批样品，同法制备20 mg／mL浓度的稀释液（A液）和含相同样品浓度及标准内毒素λm（0.25 EU／mL）的溶液（B液），每个浓度平行2管，测定［2］。结果，标准曲线回归方程为lg T＝－0.30lg C＋2.90（r＝－0.995），B液的回收率均在50%～200%，样品结果均符合规定。详见表5。

表5 动态浊度法样品细菌内毒素检查结果（n＝2）Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of samples by KTA（n＝2）

3 讨论

目前，碘克沙醇注射液生产厂家执行的质量标准各不相同。本研究结果表明，采用凝胶法和动态浊度法对4个厂家的样品进行细菌内毒素干扰试验，并按限值0.0005 EU／mg对12批样品分别进行检查，结果均符合药典规定。说明本品可采用统一的标准进行质量控制。

本研究结果显示，不干扰浓度，即最小有效稀释质量浓度凝胶法为30 mg／mL，动态浊度法为20 mg／mL。结果的细微差异可能与2种方法的观察判断标准不同有关，前者以倒转180°管内形成凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；后者是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度所需反应时间。此种现象常见于样品有干扰的情况［3－6］。凝胶法操作简单，观察结果直观，对仪器要求度低；动态浊度法检测灵敏度高，需要特定仪器和更高灵敏度的鲎试剂［7－11］。2种方法均适用于碘克沙醇注射液细菌内毒素的检查。

综上所述，2种方法均适用于碘克沙醇注射液细菌内毒素的检查。但凝胶法必须用λ为0.015 EU／mL的鲎试剂进行检查，故建议该品种细菌内毒素的检查限值设为0.0005 EU／mg，统一采用动态浊度法。