白藜芦醇对模型大鼠心肌梗死后心力衰竭的改善作用*

熊剑涛，张春龙，张诗锐，郭 琴，周承毅△，孙 娟

（1.湖北省恩施华龙总医院急诊医学科，湖北 恩施 445000； 2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院重症医学科，湖北 恩施 445000； 3.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000）

近年来，心力衰竭（HF）的发生率逐渐升高。在美国，每年新增HF病例超过500万，其中死亡病例27万［1］。目前，我国HF患者数已达420万，成人患病率超0.9%［2］。HF是多种内外因素综合作用的结果，如心肌损伤或机械负荷过重会激活交感神经系统，引发多种细胞因子的产生。同时，心肌中的信号转导通路也会被激活，随后心肌细胞会发生一系列的病理变化，如心肌代偿性肥大［3］。白藜芦醇（3，5，4′－三羟基二苯乙烯）属非黄酮类多酚化合物，具有抗癌、抗血管生成、免疫调节、心脏保护和抗氧化活性的药理学作用［4］。白藜芦醇通过下调Toll样受体4（TLR4）和核因子－κB（NF－κB）表达，减轻模型大鼠局灶性脑缺血后的炎症、血脑屏障破坏和脑损伤，对脑缺血模型大鼠发挥神经保护作用［5］；同时能改善糖尿病模型大鼠的心功能，抑制心肌细胞凋亡，参与改善线粒体功能［6］。本研究中探讨了白藜芦醇通过TLR4／NF－κB信号通路对模型大鼠急性心肌梗死后心力衰竭（HFMI）的改善作用，为白藜芦醇治疗HF提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

1.1.1 仪器

BX 60型光学显微镜（日本Olympus公司）；iMark680型多功能酶标检测仪、凝胶成像系统、蛋白电泳仪（美国Bio Rad公司）；MyLabTMSix型彩色多普勒超声诊断仪（意大利Esaote公司）；FrescoD－37520型台式冷冻高速离心机（美国Sorvall公司）；7500型PCR仪（美国ABI公司）；HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.1.2 试药

白藜芦醇（美国Sigma－Aldrich公司，批号为36227353，纯度≥99.9%）；非诺贝特（法国利博福尼制药公司，批号为H20181239）；白细胞介素6（IL－6）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号为21423472）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）ELISA试剂盒（批号为2022848）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA试剂盒（批号为20672942）和丙二醛（MDA）ELISA试剂盒（批号为20790242），均购自上海纪宁实业有限公司；RIPA裂解液（批号为P0013B）、特超敏ECL化学发光试剂盒（批号为P0018AS），均购自上海碧云天生物技术有限公司；TLR4，NF－κB，GAPDH抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；HE染色剂、辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；TUNEL凋亡检测试剂盒（德国Roche公司，批号为6432344001）。

1.1.3 动物

40只SD大鼠，雄性，体质量（210±20）g，购自湖北民族大学动物实验中心，动物生产许可证号SCXK（鄂）2019－0012。所有大鼠于鼠房适应环境，喂养1周。

1.2 方法

1.2.1 模型复制及分组、给药

将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、白藜芦醇组和非诺贝特组，各10只。腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg／kg）麻醉大鼠，仰卧保定，气管插管，连接呼吸机、麻醉剂及心电监护仪。模型组、白藜芦醇组和非诺贝特组大鼠无创性线结扎冠状动脉左前降支，随后可见结扎线下方心肌颜色发白、心电图出现S－T改变及Q波，即为急性心肌梗死模型复制成功。假手术组大鼠仅穿线，不结扎。术后2周，大鼠射血分数（EF）＜55%，即为HF模型复制成功［7］。建模成功后，大鼠灌胃给药，白藜芦醇组予白藜芦醇（30 mg／kg）［8］，非诺贝特组予非诺贝 特（100 mg／kg）［9］，假 手 术 组 和 模 型 组 予 等 体 积0.9%氯化钠溶液。每天1次，持续4周。

1.2.2 左心室功能监测

末次给药24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg／kg）麻醉大鼠（下同），监测大鼠左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV），并计算EF、缩短分数（FS），至少连续监测3个心动周期。

1.2.3 心肌结构观察

麻醉大鼠，取出心脏，用4%多聚甲醛固定左室组织72 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水，苏木素（H）染色10 min，0.7%盐酸乙醇分化数秒，流水洗涤后，伊红（E）液浸染3 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于光学显微镜下放大400倍观察。

1.2.4 IL－6，TNF－α，SOD，MDA水平检测

末次给药后，麻醉大鼠，尾静脉取血，1000 g离心20 min，取血清，按ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中IL－6，TNF－α，SOD，MDA水平。

1.2.5 心肌细胞凋亡观察

取1.2.3项下心肌石蜡切片，常规脱蜡，PBS漂洗，3%过氧化氢浸洗10 min，加入蛋白酶K工作液，37℃反应20 min，PBS漂洗后，滴加TUNEL反应混合液，37℃孵育1 h。PBS漂洗，加入转化剂，37℃孵育20 min。PBS漂洗，DAB显色。中性树胶封片。于光学显微镜下放大400倍观察。

1.2.6 TLR4和NF－κB蛋白表达水平检测

按1.2.3项下方法进行心脏取材。把心脏组织剪切成细小碎片，以RIPA裂解液裂解组织，离心，取上清液，BCA法测定蛋白含量。取30μg蛋白上样，10%SDS－PAGE电泳后湿法电转至PVDF膜上，10%脱脂奶粉封闭，随后加入TLR4（1∶3000）抗体、NF－κB（1∶3000）抗体和GAPDH（1∶5000）抗体，4℃孵育过夜。加入HRP标记二抗（1∶5000稀释）室温孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液至膜上，化学发光成像仪检测。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 左室心功能

与假手术组比较，模型组大鼠EF和FS显著降低，LVEDd和LVESd显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组和非诺贝特组大鼠的EF和FS显著升高，LVEDd和LVESd显著降低（P＜0.01）。详见图1。

图1 各组大鼠心功能比较Note：Compared with those in the sham operation group，＃P＜0.01；compared with those in the model group，*P＜0.01；as well as Fig.3 to Fig.6.A.Left ventricular structure map（HE，×400）B.Data statistics of cardiac function indexesFig.1 Comparison of cardiac function of rats in each group

2.2 心肌结构

假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，模型组大鼠心肌细胞肥大且排列紊乱，白藜芦醇组和非诺贝特组大鼠心肌细胞排列趋于整齐。详见图2。

图2 各组大鼠心肌结构图（HE，×400）Fig.2 Myocardial structure map of rats in each group（HE，×400）

2.3 炎性指标

与假手术组比较，模型组大鼠血清中IL－6和TNF－α水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组和非诺贝特组大鼠血清IL－6和TNF－α水平显著降低（P＜0.01）。详见图3。

图3 各组大鼠炎性指标比较A.IL－6 B.TNF－αFig.3 Comparision of inflammatory indexes of rats in each group

2.4 氧化应激指标

与假手术组比较，模型组大鼠血清中SOD水平显著降低，MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组和非诺贝特组SOD水平显著升高，MDA含量显著降低（P＜0.01）。详见图4。

图4 各组大鼠氧化应激指标比较A.SOD B.MDA Fig.4 Comparision of oxidative stress indexes of rats in each group

2.5 心肌细胞凋亡情况

与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组和非诺贝特组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。详见图5。

图5 各组大鼠心肌细胞凋亡情况A.Cardiomyocyte map B.Data statisticsFig.5 Cardiomyocyte apoptosis of rats in each group

2.6 TLR4和NF－κB蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠血清中TLR4和NF－κB蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组和非诺贝特组大鼠血清中TLR4和NF－κB蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。详见图6。

图6 各组大鼠TLR4和NF－κB蛋白表达水平A.Electrophoretic map B.Data statisticsFig.6 The expression levels of TLR4 and NF－κB protein of rats in each group

3 讨论

HF在老年患者中非常普遍，即使接受了最佳的药物治疗，但5年内死亡率仍很高［10－11］。目前的药物治疗可预防新发性HF的发生，延缓HF的进展，但对多数接受治疗的患者来说，预后欠佳，出院后90 d内，再住院率高（35%）［12］。

白藜芦醇能显著改善心肌梗死模型大鼠的EF，减少心肌梗死引起的左室重构和心房重构，恢复脂肪酸氧化水平，显著改善心肌能量代谢［13－14］。此外，白藜芦醇能显著抑制压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚、纤维化和心肌细胞凋亡，改善模型小鼠心功能［15］。本研究结果显示，白藜芦醇可明显改善HFMI模型大鼠的心功能，改善心肌结构。白藜芦醇还可抑制模型大鼠的心肌细胞凋亡。

氧化应激和炎症在多种疾病的进展中发挥着重要作用。研究表明，白藜芦醇可改善糖尿病并HF模型大鼠的心血管功能，显著抑制炎性因子和氧化应激标志物MDA的产生［16］。白藜芦醇对高脂饮食引起的肾损伤具有保护作用，提高肾脏抗氧化酶活性，降低肾脏MDA，TNF－α，IL－6水平［17］。本研究结果显示，白藜芦醇可降低HFMI模型大鼠血清中IL－6，TNF－α，SOD，MDA水平，从而发挥抗炎和抗氧化作用。

Toll样受体属跨膜蛋白，在先天免疫中起关键作用。NF－κB是调节生理过程、炎性反应和凋亡的重要转录因子。黄芪甲苷通过抑制TLR4／NF－κB通路而抑制心肌细胞凋亡［18］，白藜芦醇通过抑制TLR4／NF－κB信号通路，降低氧化应激和细胞凋亡，在肾缺血再灌注损伤中发挥保护作用［19］。本研究结果显示，白藜芦醇可抑制HFMI模型大鼠TLR4和NF－κB蛋白的表达水平。

综上所述，白藜芦醇可改善模型大鼠HFMI状态，其机制可能与抑制TLR4／NF－κB通路有关。