入侵性致瘿害虫桉树枝瘿姬小蜂(膜翅目：姬小蜂科)EST-SSR开发及隐种鉴定*

2021-12-01王瀚棠郭春晖杨振德丁芷柔

林业科学 2021年9期

彭欣王瀚棠郭春晖杨振德,2 周静王雪丁芷柔

(1.广西大学林学院南宁 530001； 2.广西森林生态与保育重点实验室南宁 530001)

生物入侵是21世纪最棘手的三大环境问题(生物入侵、全球变化和生境丧失)之一。随着经济全球化、国际旅游业和现代交通的飞速发展，入侵生物在各国之间传播扩散，新疫情不断突发，已入侵种频繁暴发成灾，给世界各国造成了严重的经济损失和生态灾难，也给人民健康和社会稳定带来了巨大影响，做好生物入侵的跨国研究与科学防范十分重要，迫在眉睫。为了更好阐明生物入侵的生态学过程和分子机制，我国于2018年11月启动了IAS1000计划(1 000种入侵物种基因组计划)(钱万强等， 2018)。

桉树(Eucalyptus)是世界三大速生丰产树种之一，已有5大洲96个国家和地区种植桉树，我国桉树种植面积居世界第3位。但是，随着桉树广泛种植，其害虫的种类和数量迅速增加。Hurley等(2016)研究表明，桉树人工林害虫入侵率自20世纪80年代中期以来增长近5倍。桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybeinvasa)属膜翅目(Hymenoptera)小蜂总科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)，是30多种桉属植物的外来入侵害虫，主要危害桉树嫩枝，使新叶的叶脉、叶柄和嫩枝产生典型的肿块状虫瘿，严重侵染甚至可导致植株枯死。该蜂于2000年在中东和地中海地区首次被发现， 2014年扩散到5大洲29个国家， 2018年剧增至45个国家(Mendeletal.， 2004； Zhengetal.， 2014； Leetal.， 2018)。我国于2007年在与越南交界的东兴市首次发现桉树枝瘿姬小蜂(吴耀军等， 2009)，现已蔓延至广西、海南、广东、福建、四川、江西、云南、台湾8省(区)(Zhengetal.， 2014； 2018a；张华峰等， 2013)，其中长江以南的福建、广东、广西、海南等地为其最佳适生区(黄梦伊等， 2020)。桉树枝瘿姬小蜂入侵扩散的规模和速度前所未有，已成为全球桉树的一种重要入侵性林业害虫。

Mendel等(2004)在采样过程中始终未发现桉树枝瘿姬小蜂雄虫样本，世界各地也罕有桉树枝瘿姬小蜂雄虫出现，所以一般认为桉树枝瘿姬小蜂的主要生殖方式是产雌孤雌生殖；但近几年在土耳其、印度和中国相继有桉树枝瘿姬小蜂雄虫的报道(Doanlar， 2005； Guptaetal.， 2009；陈华燕等， 2009)。Zheng等(2018b)研究发现，温度、光周期和冷热适应对桉树枝瘿姬小蜂后代性别比例和生殖策略均无显著影响。杨纤纤(2017)研究发现，我国桉树枝瘿姬小蜂雌雄虫间存在交配行为，可通过两性生殖方式产生后代。极具优势的产雌孤雌生殖方式使得桉树枝瘿姬小蜂能在入侵地快速扩张种群，从而保障其在新环境中成功入侵定殖。此外，桉树枝瘿姬小蜂是一种卵熟型寄生蜂，雌性蜂在羽化时卵巢中的卵几乎全部发育成熟，卵产出后迅速孵化出幼虫(Zhengetal.， 2018a)。Mendel等(2004)研究得出，桉树枝瘿姬小蜂在温室中从卵发育到成虫的整个过程平均需要132.6天。桉树枝瘿姬小蜂一般在国外1年发生2～3代，国内1年发生4～6代，世代重叠(寇冀蒙， 2020)。我国不同地理环境下桉树枝瘿姬小蜂每年发生的代数存在差异，广西、广东每年可发生4～5代(罗基同等， 2011；朱方丽等， 2013)，赣南和福建每年可发生3～4代(张华峰， 2013；曾凡玉等， 2015)。桉树枝瘿姬小蜂的这些生物学习性是其在我国迅速入侵扩散的重要原因。

简单重复序列(simple sequence repeat， SSR)又称微卫星(microsatellite)，是一类由1～6个核苷酸组成的基序串联重复而成的DNA序列，其在所有高等生物的编码区和非编码区均可发生(Tautzetal., 1984； Guptaetal.，1996)。SSR因符合孟德尔遗传模式，具有共显性、数量丰富、多态性高、重复性好、操作简易等优点，已被广泛用于遗传图谱绘制、遗传多样性分析、动植物分类与变异水平分析等研究领域(Madesisetal.， 2013)。基于表达序列标签开发的SSR又称EST-SSR，由于其来源于基因表达区，因此EST-SSR既有基因组SSR(G-SSR)标记的优点，又有直接标记功能基因反映相关基因多样性的优势，同时相较于G-SSR，EST-SSR具有更高的保守性和在近缘种间的通用性，可节约开发成本(孙陶泽等， 2019； Scottetal.， 2000； Bérubéetal.， 2007)。细胞色素C氧化酶亚基I基因(cytochrome C oxidase subunit I, COI)来源于线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)，mtDNA具有母系遗传、相对保守、无内含子、进化速率较快(昆虫中线粒体基因的进化速度大概是核蛋白编码基因的2～9倍)、较少发生序列缺失和插入等特点(Linetal.， 2004)，已被广泛用于昆虫种类鉴定以及隐种发现等领域(刘慎思等， 2012)。

隐种是昆虫系统分类和种群遗传研究共同关注的重点问题，隐种鉴定不仅对于入侵生物学的理论研究具有重要意义，而且对入侵种的防控也具有重要指导价值，有助于生物防治中采用正确的生物型，一些地区害虫生物防治方法失效可能是该害虫中存在隐种所致(Maponderaetal.， 2012； Schröderetal.， 2020； Dittrich-Schröderetal.， 2020)。如全球入侵性害虫烟粉虱(Bemisiatabaci)在我国有19个隐种，包含17个本地种和2个外来种(MED和MEAM1)(Huetal.， 2018)。因此，开展害虫防治前应对不同隐种进行鉴定区分。线粒体COI 标记表明，桉树枝瘿姬小蜂具有3种不同的线粒体单倍群，即隐种A、B、C，其中隐种A 主要分布于欧洲、中东、南美和非洲大部分地区，隐种B与隐种A共同分布于老挝、南非、泰国和越南等地，而隐种C 仅在澳大利亚本土范围出现(Dittrich-Schröderetal.， 2018)。虽然桉树枝瘿姬小蜂入侵我国已有14年历史，文献报道江西赣州的桉树枝瘿姬小蜂属于隐种B(Dittrich-Schröderetal.， 2018； Nugnesetal.， 2015)，但关于中国种群的桉树枝瘿姬小蜂是否存在其他类型隐种尚不清楚。

鉴于此，本研究基于桉树枝瘿姬小蜂3个地理种群转录组测序数据筛选EST-SSR位点，以8个地理种群的桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本用于EST-SSR的开发，并对14个地理种群的桉树枝瘿姬小蜂进行隐种鉴定，以期为桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究开发可靠的EST-SSR标记，为该害虫在生物防治中采用正确的生物型提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及转录组测序

桉树枝瘿姬小蜂样本采集时间为2016―2020年，14个地理种群样本采样信息见表1。样本采集后立即放入无水乙醇中固定，于-80 ℃冰箱中保存。由于采集到的桉树枝瘿姬小蜂雄性成虫样本有限，且使用单倍体雄虫开发SSR引物无法体现共显性分子标记的优势(区分二倍体杂合子)，不能很好展现SSR引物的多态性，故本研究仅选用桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫进行后续试验分析。

选取8个样本量充足的地理种群，每个地理种群有3个桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本DNA用于后续EST-SSR的开发，对采集到的全部14个地理种群320个桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本进行隐种鉴定。用于转录组测序的桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本分别采自广西梧州、广西南宁1、四川攀枝花，分为3组，每组3个生物学重复，每个重复样本量0.5 g。转录组测序委托北京百迈客生物科技有限公司进行，测序平台为Illumina HiSeqTM2000。

1.2 DNA提取

采用动物组织DNA提取试剂盒(北京擎科新业生物技术有限公司)，参照说明书提取单头桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫总基因组DNA，使用NanoDrop以260 nm/280 nm和260 nm/230 nm比值测定DNA的质量和浓度，检测合格的DNA分装3管，于-20 ℃冰箱中保存。

表1 桉树枝瘿姬小蜂14个地理种群采样信息Tab.1 Sampling information of 14 geographic populations of L. invasa

1.3 SSR位点鉴定

利用软件MISA(https:∥webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索unigenes的微卫星标记，按照以下标准从unigenes中查找 EST-SSR位点：单核苷酸重复≥10次，二核苷酸重复≥6次，三核苷酸重复≥5次，四核苷酸重复≥5次，五核苷酸重复≥5次，六核苷酸重复≥5次。如果2个SSR序列的距离短于100 bp，会被合并当作一个EST-SSR标记。

1.4 EST-SSR引物设计与筛选

以上述筛选的EST-SSR位点为基础，利用Primer Premier 3(Untergasseretal.， 2012)软件在EST-SSR序列两侧进行引物批量设计，引物长度设为18～26 bp，最适长度为23 bp，扩增目的片段为重复序列前1个到后5个碱基片段，扩增产物长度在100～400 bp之间。从中选取400个EST-SSR位点进行初筛，所需引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。从广西防城港2、四川攀枝花、广西南宁1种群中各取1个样本DNA用于初筛，每对引物用上述3个样本DNA进行PCR扩增并应用1%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、清晰可见，与目的片段大小一致的引物。PCR反应体系为25.0 μL，包含2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL(北京擎科新业生物技术有限公司)，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加9.5 μL ddH2O补足体系； PCR反应程序为98 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，适宜温度退火10 s，72 ℃延伸10 s，反应35个循环后，72 ℃延伸2 min。为了尽可能表现出位点的多态性，从广西防城港2、广西南宁1、广西南宁2、广西梧州、四川德阳、四川攀枝花、福建三明、江西赣州8个种群中各选取3个样本(共24个样本)DNA对有效扩增的引物进行二次筛选，并用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。PCR反应体系与程序同上。

1.5 桉树枝瘿姬小蜂G-SSR多态性引物验证

结合Dittrich-Schröder等(2018)开发的14对多态性G-SSR引物(LiSS1—LiSS14)，对我国8个地理种群24个样本DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系和程序同上，扩增产物通过8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性检测。

1.6 隐种鉴定

利用线粒体COI基因序列引物LiLCO1490(5′-ATTTGATCTGGAATTTTAGG-3′)HCO2198(5′-TAAA CTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal.， 1994； Dittrich-Schröderetal.， 2018)对14个地理种群320个桉树枝瘿姬小蜂雌性成虫样本进行PCR扩增，PCR反应体系为50.0 μL，包含2×T5 Super PCR Mix 25.0 μL(北京擎科新业生物技术有限公司)，正反向引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，加19.0 μL ddH2O补足体系； PCR反应程序为98 ℃预变性3 min，98 ℃变性40 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，反应35个循环后，72 ℃延伸2 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶、纯化后送至上海生工生物工程股份有限公司进行双端测序。

以Dittrich-Schröder等(2018)鉴定出的桉树枝瘿姬小蜂隐种A、B、C的COI基因序列(GenBank登录号分别为MH093212、MH093120和MH093002)为参考，利用PhyloSuite v1.1.15软件(Zhangetal.， 2020)对14个地理种群320个桉树枝瘿姬小蜂样本COI基因序列进行MAFFT比对并用Gblocks程序提取保守序列；比对完成的序列利用MEGAX v7.0软件(Kumaretal.， 2016)以Kimura 2-parameter模型建立 Neighbor-Joining(NJ)系统发育树。

2 结果与分析

2.1 桉树枝瘿姬小蜂转录组的测序与组装

转录组测序数据经过滤后获得277 048 525条clean reads，包含82.86 G个核苷酸，Q20为97.45%，Q30为93.62%，GC含量为43.30%，表明测序结果良好，可信度高。组装后共得到44 878个unigene，平均长度为1 082.76 bp，N50为1 976 bp。随着序列长度增加，unigene数量逐渐减少(表2)。

2.2 桉树枝瘿姬小蜂转录组中SSR位点分布特点

对桉树枝瘿姬小蜂转录组的44 878条unigenes序列(总长约 48 592 kb)进行搜索，检测到14 190个EST-SSR位点，平均每3.42 kb出现1个SSR位点。不同重复类型的EST-SSR在总EST-SSR中所占比例情况(表3)为：单苷酸重复所占比例最高(9 881个，69.63%)，其次为二核苷酸重复(2 295个，16.17%)和三核苷酸重复(1 917个，13.51%)，四、五、六核苷酸重复共97个，占0.69%。转录组EST-SSR重复次数在4～24次之间，单核苷酸重复次数在10～24次之间，二核苷酸重复次数在6～12次之间，三核苷酸重复次数在5～8次之间，四核苷酸重复次数在5～10次之间，五核苷酸重复次数在5～11次之间，六核苷酸重复次数在5～8次之间。在单核苷酸重复类型(表4)中，A/T类型具有绝对优势，占98.03%；在二核苷酸重复类型中，GA/TC最多，其次为AG/CT，分别占26.27%和23.14%；在三核苷酸重复类型中，TGC/GCA类型最多，占13.67%，其次为CAG/CTG(12.52%)、AGC/GCT(10.02%)。

表2 桉树枝瘿姬小蜂转录组组装质量Tab.2 Transcriptome assembly quality of L. invasa

表3 桉树枝瘿姬小蜂不同类型EST-SSRs重复次数统计Tab.3 Repeated number statistics of EST-SSRs of different types in L. invasa

2.3 EST-SSR位点筛选及G-SSR引物多态性

从EST-SSR库中选取400个微卫星位点，包含二核苷酸重复160个、三核苷酸重复220个、四核苷酸重复20个，经初筛共得到205对条带单一、清晰可见，与目的片段大小一致的引物，扩增效率为51.25%。利用8个地理种群24个样本进行二次筛选共得到10个多态性良好的EST-SSR位点，位点详情及引物序列见表5，c127471引物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。国外14对G-SSR引物均能有效扩增得到目的片段，其中仅有LiSS2、LiSS5、LiSS13存在多态性，这3对多态性G-SSR引物用于后续种群遗传学研究。

表4 桉树枝瘿姬小蜂EST-SSRs重复基元类型统计Tab.4 Statistics on repeat motifs type of EST-SSRs in L. invasa

表5 桉树枝瘿姬小蜂10对多态性EST-SSRs与国外3对多态性G-SSRs引物信息①Tab.5 Information of 10 polymorphic EST-SSRs and 3 polymorphic G-SSRs primers of L. invasa

图1 桉树枝瘿姬小蜂c127471引物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.1 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis image of L. invasa c127471 primerM： DNA分子量标记DNA molecular weight marker； GXNN1：广西南宁1 Nanning 1, Guangxi； JXGZ：江西赣州 Ganzhou, Jiangxi； FJSM：福建三明 Sanming, Fujian； SCPZH：四川攀枝花 Panzhihua, Sichuan； SCDY：四川德阳 Deyang, Sichuan； GXWZ：广西梧州 Wuzhou, Guangxi； GXNN2：广西南宁2 Nanning 2, Guangxi； GXFCG2：广西防城港2 Fangchenggang 2, Guangxi.

2.4 中国种群桉树枝瘿姬小蜂隐种鉴定

经序列比对,最终得到320条605 bp的COI基因序列(GeneBank登录号为MZ378835—MZ379154)；聚类结果显示，隐种A有104个样本，隐种B有216个样本，暂未发现隐种C样本(图2)。江西赣州、广西防城港1、广西防城港2、广西南宁1、广西南宁2、四川攀枝花、广西梧州种群同时存在隐种A、B，四川德阳、福建三明、海南儋州、云南昆明、广西来宾、广西玉林、广西钦州种群仅存在隐种B；不同种群隐种A、B所占比例存在明显差异，江西赣州、广西防城港1、广西梧州种群以隐种A样本为主，其他种群以隐种B样本为主(表6)。

2.5 全球桉树枝瘿姬小蜂隐种统计

从NCBI数据库下载全球5大洲18个国家共511条桉树枝瘿姬小蜂COI基因序列数据，对全球各国家和大洲进行隐种统计(表7)，可以看出老挝、泰国、越南和南非均存在不同程度的隐种A、B混合现象，澳大利亚存在隐种B、C，美洲和欧洲仅存在隐种A。

图2 基于桉树枝瘿姬小蜂COI基因序列构建的NJ系统发育树Fig.2 NJ phylogenetic tree constructed based on L. invasa COI gene sequence样本序号后面的大写字母A、B代表各样本所属的隐种类型；样本MH093212、MH093120和MH093002分别为隐种A、B、C的参考序列。The capital letters A, B after the samples No.represent the cryptic species type of each samples; Samples MH093212, MH093120 and MH093002 are the reference sequences of cryptic species A, B and C, respectively.

表6 桉树枝瘿姬小蜂隐种鉴定结果统计Tab.6 Statistical of L. invasa cryptic species identification result

3 讨论

随着经济全球化、国际旅游业和现代交通飞速发展，外来物种入侵日益严重。生物入侵不仅会对生态系统的生物多样性造成严重破坏，而且会对当地生态环境的稳定产生负面影响。SSR是种群遗传学研究中常用的分子标记之一，但是SSR用于非模式生物必须先进行多态性引物开发，尤其是传统G-SSR发掘方法在微小的昆虫中应用较为困难(魏丹丹等， 2014)，这极大限制了对非模式昆虫的研究。随着二代测序技术的快速发展，基于转录组数据开发EST-SSR克服了微卫星位点获取困难、成本高等弊端，从而促进了对非模式昆虫微卫星的研究进展。

桉树枝瘿姬小蜂转录组44 878个unigenes中共发掘出14 190个EST-SSR位点，EST-SSR出现频率为31.62%(EST-SSR个数与unigenes个数之比)，这与梨网蝽(Stephanitisnashi)(40.37%)(谢瑾燕等， 2019)、中华蜜蜂(Apisceranacerana)(30.87%)(熊翠玲等， 2017)等的EST-SSR出现频率相当；但与橘小实蝇(Bactroceradorsalis)(4.23%)(魏丹丹等， 2014)、齿缘刺猎蝽(Sclominaerinacea)(5.67%)(黎东海等， 2019)、东方黏虫(Mythimnaseparata)(11.51%)(李微等， 2017)、窄足真蚋[Simulium(Eusimulium)angustipes](68.33%)(郭欢等， 2018)等昆虫差异较大。造成这种差异的主要原因可能是物种不同，也可能与EST-SSR筛选标准以及RNA质量有一定关系。

SSR长度是影响其多态性的重要因素，当SSR长度≥20 bp时多态性较高，SSR长度在12～20 bp之间时多态性中等，而SSR长度在12 bp以下时多态性较低(Temnykhetal.， 2001)。转录组是生物体某个细胞或组织在特定时间内的表达情况，EST-SSR核心序列重复次数往往不高，同时具有较高的保守性，因此EST-SSR多态性通常比G-SSR低(魏丹丹等， 2014；郭欢等， 2018)。桉树枝瘿姬小蜂的EST-SSR长度集中在10～15 bp之间，占76.76%，仅有4.49%的EST-SSR长度≥20 bp，且多为单核苷酸重复类型，因此桉树枝瘿姬小蜂可能具有较低的遗传多态性。

表7 全球桉树枝瘿姬小蜂隐种比例统计Tab.7 Statistics on the proportion of cryptic species of L. invasa in the world

为了得到质量较高且多态性良好的引物，引物筛选时本研究优先选择核心重复序列较长的EST-SSR位点设计引物，共选取400对EST-SSR引物进行开发；其中一半引物扩增失败，分析其原因可能是引物序列中的内含子阻止了引物退火，或者在引物侧翼区域存在一个较大的内含子干扰PCR扩增(Sahaetal.， 2004)；有205对扩增得到预期大小条带，占合成引物的51.25%，引物扩增效率低于意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)(91.67%)(郭睿等， 2018)、星天牛(Anoplophorachinensis)(88.33%)(韩小红等， 2019)、沙葱萤叶甲(Galerucadaurica)(100%)(张鹏飞等， 2016)，但高于齿缘刺猎蝽(29.63%)(黎东海等， 2019)、意大利蝗(Calliptamusitalicus)(25.00%)(桑迪等， 2020)。

SSR多态性并非完全取决于SSR引物自身的多态性，与物种自身遗传多样性高低也有着密切联系。Dittrich-Schröder等(2018)利用14对桉树枝瘿姬小蜂G-SSR引物(LiSS1—LiSS14)研究发现，澳大利亚原始种的遗传多样性显著高于其他入侵地区，且仅有部分G-SSR引物在入侵地区桉树枝瘿姬小蜂样品中存在多态性。国外14对G-SSR引物中仅有3对引物在我国桉树枝瘿姬小蜂样本具有多态性，说明国外G-SSR引物仅有少数可用于我国桉树枝瘿姬小蜂种群遗传学研究，因此在进行种群遗传学研究前，需要开发更多的多态性SSR引物进行联合分析才能得出准确的结论。

据报道，我国江西赣州的桉树枝瘿姬小蜂均属于隐种B(Nugnesetal.， 2015)，但笔者于2016年采样时发现江西赣州种群中93.75%的桉树枝瘿姬小蜂为隐种A。出现这种情况一方面是由于以往研究采集的样本量较少，有漏采隐种A的可能；另一方面可能是因为采样点不同造成的。本研究广西防城港2个采样点相隔仅40 km，但是其隐种比例却完全相反，广西防城港1种群桉树枝瘿姬小蜂样本的93.75%为隐种A，而广西防城港2种群桉树枝瘿姬小蜂样本的96.88%为隐种B，这说明我国桉树枝瘿姬小蜂的隐种分布可能并非自然传播形成，而是人为活动的结果，且不同隐种的桉树枝瘿姬小蜂可能存在完全不同的入侵扩散路线，从而使得不同种群桉树枝瘿姬小蜂的隐种比例分布不均。总体来说，我国桉树枝瘿姬小蜂隐种B在数量上更占优势，隐种B可能比隐种A更先入侵我国。由于我国桉树枝瘿姬小蜂隐种类型与东南亚各国相近，故推测我国桉树枝瘿姬小蜂可能起源于东南亚。

随着桉树枝瘿姬小蜂在世界范围入侵扩散程度加剧，其隐种混合将成为未来的大趋势。部分亚洲和非洲国家桉树枝瘿姬小蜂隐种大量混合，势必使得当地种群成为桉树枝瘿姬小蜂在世界范围传播扩散的桥头堡种群，隐种混合可能导致渗透杂交而产生更适应环境的新基因型(Dittrich-Schröderetal.， 2018)。我国大面积单一品种的桉树种植区为桉树枝瘿姬小蜂快速适应新环境提供了良好条件，江西赣州、四川攀枝花、广西梧州、广西防城港1、广西南宁1等种群均出现隐种混合现象，这些地理种群将有可能成为桉树枝瘿姬小蜂在我国持续传播扩散的桥头堡种群，随着各地隐种混合加剧，桉树枝瘿姬小蜂的入侵性有可能进一步增强。