枫香根际丛枝菌根真菌多样性*

2021-12-01吴祝华翁行良杨学祥唐荣林沈厚宇任嘉红陈凤毛

林业科学 2021年9期

宋娟吴祝华翁行良赵邢杨学祥唐荣林曹兵巫昱沈厚宇任嘉红陈凤毛

(1.南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京 210037； 2.江苏省句容市句容林场句容 212424；3.长治学院生命科学系长治 046011)

枫香(Liquidambarformosana)为金缕梅科(Hamamelidaceae)枫香亚科(Subfam.Liquidambaroideae)枫香属树种，是我国重要的阔叶乔木乡土彩叶树种,广泛分布于我国南方各省，在中国18个省(市、区)都有天然分布。在海拔220～2 000 m的丘陵、平原或者山地常绿落叶林中枫香生长迅速，对环境适应性强，是荒山造林、混交造林的优良树种(胡文杰等， 2018),在我国亚热带次生林演替过程中起到重要作用(黄立军等， 2015)。枫香还具有观赏、药用、工业等商用价值(Lietal., 2013; 刘伟等， 2019；唐生森等， 2020；洪震等， 2021；裴云霞等， 2020；史久洲等， 2020)，人们对它的需求量与日俱增，而人为的过度采集以及生态环境破坏的加剧，致使中国枫香资源蕴藏量和产量都在大幅下降，因此，加强影响枫香产量和质量因素研究十分重要。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是林地土壤中最普遍、最重要的真菌类群，能与80% 以上的陆生植物共生(Harrison, 2012; Cornejoetal., 2017; Armansyahetal., 2018)。AMF能促进宿主植物对水分及土壤氮、磷、钾、矿质营养元素的吸收(Philipsetal., 1970)，提高植物对干旱、盐碱、重金属等土壤逆性环境及病原真菌、病原线虫、害虫等生物逆境的抵御能力(Bradleyetal., 1981; Arocaetal., 2010; Medinaetal., 2010; Ruizlozanoetal., 2012; Wuetal., 2013; Van der Heijdenetal., 2015; Santanderetal., 2019)，从而改善宿主植物的生长状况。同时，土壤理化因子(土壤pH、有效氮、有效磷和有机质等)、宿主植物和生境异质性均对 AMF 群落结构的形成有重要作用(Kivlinetal., 2011; Davisonetal., 2015; Donetal., 2017; Bonneretal., 2018)。AMF多样性能够有效调节植物产量和品质, 而土壤养分变化所导致的AMF群落的变化可能会进一步影响植物生长，进而对整个生态系统产生影响。目前对AM共生的研究仍然较少 (黄京华等， 2018)，任嘉红等(2008)采用形态法对中国特有树种南方红豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)，刘辉等(2017)对安徽茶区茶树(Camelliasinensis)，李一叶等(2003)对长白山赤杨(Alnus)进行AMF多样性调查。而对于荒山先锋树种枫香根际AMF的研究还鲜见报道(宋娟等， 2020)。本研究选择枫香资源丰富、树龄构成多样的安徽、湖北两省枫香林地为研究对象，应用形态学方法比较研究了20个枫香林区土样的AMF多样性及枫香菌根感染状况；结合环境因子分析该区域AMF 群落结构的主要影响因素；通过测定不同树龄枫香林真菌和根际土壤因子的空间分布，分析“植物 -土壤 -微生物”三者之间的内在联系，以期为 AMF在安徽、湖北两省枫香林地生态恢复中的应用提供参考，为枫香人工栽培与生物菌肥的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

湖北设2个样地： 1)九峰山森林公园(114°34′E, 30°46′N)，地处亚热带季风性湿润气候区，全年平均气温为16.3 ℃，年降雨量1 200～1 400 mm； 2)三角山(115°38′E, 30°36′N)，生物资源丰富，森林茂密，年降雨量882～1 397 mm，夏季最高气温28～31 ℃。安徽设3个采样地： 1)黄山(118°21′E, 30°15′N)，地处亚热带季风气候区，红壤黄壤地带，夏季最高气温27 ℃，冬季最低气温-22 ℃，年均气温7.8 ℃，山上全年降水量为2 395 mm； 2)黄山林科院(118°32′E, 29°84′N)，属亚热带季风湿润气候，年均气温15.5～16.4 ℃，降水量1 395～1 702 mm； 3)稽灵山(118°3′E, 29°7′N)，地处中亚热带北缘，年均气温 16.3 ℃，降水量为1 670 mm。5个典型地段由自然选择压力形成了它们特有的微生物群落，用空间代替时间的方式选取具有特定环境背景的枫香自然林和人工林作为研究对象来设置样地。样地各设置10 m × 10 m的样方，每隔约 6 m 距离，选取长势良好的枫香，其树龄范围在10～100 年进行采样。采集枫香根系和根际土样。在每个采样地点随机选取4棵枫香，每棵树树冠下选4个方位，选取其5～25 cm 深层土样及根系，采用经典的抖落法收集根际土，轻轻地抖动根系，仍然黏附于根系表面4 mm范围内的土壤为根际土壤。采集土壤样品约1 kg，装入无菌自封袋中，4 h内带回实验室，将根系从土壤样品中捡出，与土壤样品同样标示；根样用清水洗净后剪成1 cm长根段置于FAA固定液中固定，土样风干后装入塑料袋中于4 ℃冰箱保存。

记录地形、气候、土壤类型、土壤质地等(弓明钦等， 1997)，并用地温计直接测定土壤温度。

1.2 土壤理化性质分析

将根际 5～25 cm土样，风干后捣碎过筛，检测土壤理化性质指标。土壤有机质含量的测定使用重铬酸钾容量法——外加热法测定(NY/T 1121.6-2006)； pH采用电极电位法(鲍士旦， 2000)测定；过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法(关松荫， 1986)；蔗糖酶活性测定采用 3,5-二硝基水杨酸比色法(杨泉女等， 2017)；土壤含水率采用烘干法测定。

1.3 球囊霉素的测定

按照Wright等(1998)方法测定总球囊霉素(total glomalin, TEG)和易提取球囊霉素(easily extractable glomalin, EEG)含量。

1.4 菌根结构观察及侵染

枫香根样用清水洗净，用洁净吸水纸吸去水分。将根样放入锥形瓶中，加入适量的10% (质量分数)KOH，90 ℃水浴加热30 min。清洗样品后，加入 5%(体积分数)的乳酸酸化4 min，去掉酸液。锥虫蓝溶液[0.05%(质量分数)锥虫蓝加乳酸酚]染色30 min。将上述已经染色的样品取出，再用乳酸甘油浸泡多次，直到根样中多余的染料大部分被清除为止。脱色后的根段制成临时封片，显微镜下观察根内AMF的(菌丝、丛枝和泡囊等) 结构，并拍照。

1.5 AMF的分离与鉴定

采用湿筛倾析法(Iansonetal., 1986)分离 AMF 孢子。在体视显微镜(ZEISS AXIO Imager 2; Zeiss)下记录孢子数量，按照孢子大小、颜色、表面纹饰、连孢菌丝等特征进行分类，使用ZEISS显微镜(ZEISS AXIO Imager M 2; Zeiss)进行压片观察。根据Zubek等提出的分类系统，并参阅国际AM菌种保藏中心[International Culture Collection of (Vesicular)Arbuscular Mycorrhizal Fungi, INVAM]提供的种属的描述及图片进行，并结合近年来的新记录种 (http:∥www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp)发布的AMF菌种形态特征信息进行综合分析研判，对样本中的AMF种的鉴定，鉴定到属和种(Blaszkowskietal., 2012)。

AMF种的孢子密度(spore density，SD)为每50克土样含有的孢子数目；相对丰度(relative abundance,AR)为某采样点中AMF某种或属在该样本总体中出现的频度；FRF为某属或种AMF在样品总体中的出现率，即FRF=(AMF 某属或种出现次数/土样数)×100%； AMF种的丰度(species richness，SR)：指枫香根际每50 g土壤中AMF种的数目；重要值(Iv)=(FRF+AR)/2,Iv≥ 50% 为优势属或种，10%

AMF孢子密度Shannon多样性指数(H)，计算公式如下：

H=-∑PilnPi。

式中，Pi=Ni/N，式中Ni表示第i个种的孢子数目，N为群落中AMF孢子的总数。

Simpson多样性指数计算公式为：

D=1-∑(Pi)2。

均匀度计算公式为：J=H/lnS,S即为物种丰富度指数。

1.6 数据分析

采用SPSS13.0和Microsoft Excel分析数据。使用CANOCO 4.5软件进行AMF多样性与土壤理化性质之间的冗余分析(Redundancy analysis，RDA)(ter Braaketal., 2002)。差异显著性分析利用SPSS13.0中的 ANOVA进行LSD检验。树龄与丛枝菌根真菌多样性的相关性图用R(version 3.4.2)制作。

2 结果与分析

2.1 不同样地土壤理化性质

20个不同枫香林样地土壤理化性质表现出不同的变化趋势(表 1)。其中，土壤pH在样地之间变化不明显，土样均呈酸性(pH<7)。土样的含水率为15.20%～20.20%。土壤过氧化氢酶、土壤有机质含量在20个采样地之间具有显著性差异(P< 0.05)(表 1)。安徽黄山的土壤过氧化氢酶活性(2.8 ± 0.03)U· g-1、土壤有机质含量 (2.85 ± 0.01)mg·kg-1均显著高于其他样地(表 1)。黄山林科院土样过氧化氢酶(0.9 ± 0.02 )U· g-1、土壤有机质含量(1.14 ± 0.57)mg·kg-1,均为最低。土壤蔗糖酶在湖北九峰山森林公园显著高于安徽稽灵山样地 (P< 0.05)。20个土样采样地的土壤蔗糖酶呈显著性差异(P< 0.05)。

表1 枫香根际土壤理化性质①Tab.1 Soil physical and chemical properties for each of the L. formosana rhizosphere soils sampled

2.2 土样球囊霉素含量分析

球囊霉素(Glomalin)是AMF的菌丝产生的一种含金属离子的糖蛋白，不同采样点枫香根际土壤总球囊霉素含量(T-GRSP)和易提取球囊霉素(EE-GRSP)含量(图1)可见，样地间差异不显著(P>0.05)。采样地总球囊霉素含量1.01～2.01 mg·g-1，湖北九峰山森林公园采样地总球囊霉素含量最高(2.01 mg·g-1)，安徽黄山采样地总球囊霉素含量最低(1.01 mg·g-1)。易提取球囊霉素含量在0.62～0.84 mg·g-1之间，黄山林科院、湖北九峰山森林公园采样地易提取球囊霉素含量较高，安徽黄山采样地易提取球囊霉素含量最低(0.62 mg·g-1)。样地土样中易提取球囊霉素更易于向总球囊霉素转化，易提取球囊霉素、总球囊霉素含量变化趋势相一致。

图1 不同采样点枫香根际土壤的球囊霉素含量Fig.1 The glomalin-related soil protein(GRSP) concentrations in the root zone of L. formosana at different sampling sites

2.3 枫香根系 AMF形态特征、侵染状况和孢子密度

对采集的枫香根样进行锥虫蓝染色发现， 20个采样地枫香根部中均有不同程度的 AMF侵染。由图2可知，AMF菌丝在宿主枫香根系外蔓延生长，形成根外菌丝，根外偶见孢子(图 2A)； AMF菌丝侵染枫香根系进入皮层细胞内形成根内菌丝并连续二分叉式生长形成丛枝(图2B、C)；菌丝多为无隔菌丝，偶有有隔菌丝形成，根内菌丝一部分顶端膨大形成泡囊，泡囊形状有圆球形、椭圆形、棒形和不规则形(图2D-F)。以上结构均为AM形成的典型结构。

图2 枫香根系AMF侵染状况Fig.2 AMF infection rate of the roots in L. formosanaA：根外菌丝(Eh)及孢子(S)； B：根外菌丝(Eh)、根内菌丝(Ih)和丛枝(Ar)； C：丛枝(Ar)； D、E、F：泡囊(V)和根内菌丝(Ih)。A: Hyphae(Eh) and spore(S); B: Hyphae(Eh), internal hyphae(Ih) and arbuscule(Ar); C: Arbuscule (Ar); D,E,F: Vesicle(V) and internal hyphae(Ih).

不同采集地枫香根际AMF的孢子密度差异较大，其分布范围在86～275个·(50 g)-1土，平均孢子密度为166个·(50 g)-1土(图3)。安徽稽灵山枫香根际AMF的孢子密度最高[275个·(50 g)-1土]，安徽黄山最低[86个·(50 g)-1土](图3)。各采样地枫香根样均被AMF侵染，侵染率范围在49.43%～73.84%之间，平均侵染率为 62.07%。安徽稽灵山的侵染率最高(73.84%)，湖北九峰山森林公园枫香根样的侵染率最小(49.43%)(图3)。枫香根内AMF的丛枝及泡囊较多，表明枫香易被AMF侵染。

图3 不同采样点枫香菌根侵染状况和孢子密度统计Fig.3 Statistics AMF infection rate and spore density at different sampling sites

2.4 AMF和球囊霉素与土壤因子的相关性分析

RDA分析表明：土壤的5个参数，即土样过氧化氢酶活性 (U·g-1)、土壤有机质 (mg·kg-1)、土壤蔗糖酶活性 (U·g-1)、土壤球囊霉素含量(mg·g-1)和土壤pH值与采样点的AMF群落组成、根样侵染率和AMF的孢子总数相关(图4)。RDA的前2个轴的特征值分别为0.571和0.066。RDA排序轴总体解释了67.40% 的物种-环境关系的变化值。土壤过氧化氢酶活性、土壤有机质、土壤pH和土壤蔗糖酶活性对AMF多样性的影响极为显著(P< 0.05)。其中，土壤pH和土壤过氧化氢酶对AMF多样性影响最大，土壤蔗糖酶和总球囊霉素含量呈正相关(R=0.705,P< 0.05)，土样pH与枫香根系 AMF侵染率呈显著正相关(R=0.633,P< 0.05)，而土壤总球囊霉素含量和土壤过氧化氢酶活性呈显著负相关(R=- 0.707,P< 0.05)(图4)。

图4 AMF多样性与土壤因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis(RDA) showed the relationship between AMF diversity and soil factorsCatala：土样过氧化氢酶活性； SOC：土壤有机质含量； Infec：根侵染率； SpN：孢子总数； EE-GRSP：土壤易提取球囊霉素含量； T-GRSP：土壤总球囊霉素含量； Sosac：土壤蔗糖酶活性； AS1：黄山AMF种的丰度 (SR)； AS2：稽灵山AMF的 (SR)； AS3：黄山林科院AMF的丰度 (SR)； AS4：九峰山森林公园AMF的丰度(SR)； AS5：武汉三角山AMF的丰度(SR)。Catala: Catalase activity; SOC: Organic carbon content; Infec: Infection rate; SpN: Spore number; EE-GRSP: Easily extractable glomalin content; T-GRSP: Total glomalin content; Sosac: Soil saccharase content; AS1: AMF species richess in Huangshan, Anhui; AS2: AMF species richess in Jiling Mountain, Anhui Province; AS3: AMF species richess in Huangshan Academy of Forestry; AS4: AMF species richess in Jiufengshan Forest Park, Hubei; AS5: AMF species richess in Wuhan Sanjiao Mountain.

2.5 枫香根际AMF资源的分布状况

本研究共分离出11属46种AMF(表2)。其中球囊霉属 (Glomus)12种，占分离AMF总数的26.09%；无梗囊霉属 (Acaulospora)13种，占分离AMF总数的28.26%；盾巨孢囊霉属(Scutellospora)5种，占分离AMF总数的10.87%；巨孢囊霉属(Gigaspora)2种，占分离AMF总数的4.35% ；近明囊霉属(Claroideoglomus)和管孢囊霉属(Funneliformis)分别为4种，占分离AMF总数的15.38% ；平囊霉属(Pacispora)、根生囊霉属(Rhizophagus)、多样孢囊霉属(Diversispora)、隔球囊霉属(Septoglomus)和两性囊霉属(Ambispora)各1种，占分离AMF总数的2.22%。

枫香根际土壤分离到AMF优势属有：无梗囊霉属、球囊霉属、盾巨孢囊霉属、近明囊霉属和管孢囊霉属。其中，无梗囊霉属以蜜色无梗囊霉(A.mellea)、孔窝无梗囊霉(A.foveata)和浅窝无梗囊霉(A.lacunosa)3个种的出现频率最高(表2)；球囊霉属则以黑球囊霉(G.melanosporum)和地球囊霉(G.geosporum)的出现频率最高；盾巨孢囊霉属以群生盾巨孢囊霉(S.gregaria)出现频率最高(表 2)。这6个种应为枫香根际中AMF的优势种。

2.6 AMF多样性分析

不同取样地枫香根际AMF多样性指数均存在显著性差异(P< 0.05)(表3),安徽黄山枫香根际AMF种的丰度为16种·(50 g)-1干土，Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数均最小，说明该地区枫香AMF多样性偏低；湖北九峰山森林公园取样地AMF种的丰度为31种·(50 g)-1干土，Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数均最大，说明该地区枫香多样性指数偏高。

2.7 枫香 AMF 多样性与树龄的相关性

由图 5可知，枫香树树龄与其AMF的属数和Shannon指数呈正相关; AMF的属数和Simpson指数呈显著正相关(P< 0.05)，而枫香树树龄与其AMF种的丰度呈负相关。

3 讨论

枫香为我国重要的观赏、药用与经济树种，因其是直根系，移栽培育成活率较低，是限制枫香广泛开发利用的一个瓶颈。选择有益微生物培育枫香侧须根生长，是枫香栽培成功的关键技术之一(张玲等， 2013；宋娟等， 2020)。丛枝菌根真菌(AMF)广泛分布于自然界中，与植物形成共生体AM后具有促进宿主植物生长、改善作物品质等多种功能(Briccolietal., 2015; Haninetal., 2016; Begumetal., 2019)，但有关AMF与枫香共生的研究仍然较少。笔者从枫香根际土样中共分离AM真菌11属46种，根样侵染率在49.43%～73.84%，平均侵染率为 62.07%，这表明枫香有很高的菌根侵染率，而且真菌物种较丰富。因此，接种AMF来提高枫香的繁殖率具有广阔的应用前景，AMF将是枫香丰产优质的一种重要的微生物资源。

本研究各采样土壤中AMF的各属孢子密度、分离频度、相对多度、重要值在总体上呈：球囊霉属 > 无梗囊霉属 > 盾巨孢囊霉属，这种属的分布特征与施晓峰等(2017)的研究结果一致。各样地球囊霉属均占有绝对的优势，这可能是因为球囊霉属的高产孢率使其在各种环境条件下均能定殖(Pereiraetal., 2014)，以及其很高的竞争力和适应性，从而使其比别的属更容易生存。本研究结果也进一步验证了球囊霉属在安徽、湖北枫香生长取样区环境中也具有极强的适应能力。另外，枫香根际蜜色无梗囊霉、孔窝无梗囊霉、浅窝无梗囊霉、黑球囊霉、地球囊霉和群生盾巨孢囊霉分布于所有采样地的土壤中，在不同样地都占绝对优势。这些种可能更适应于在湖北和安徽取样地枫香根际的环境条件下生存。

表2 不同样地枫香植物根系AM真菌种类Tab.2 AM fungi species in the roots of L. formosana

续表2 Continued

表3 枫香根际AMF多样性①Tab.3 The diversity index of AMF in the roots of L. formosana

图5 AMF多样性与树龄之间的相关关系Fig.5 Relationships of AMF community structure with tree ageV1:树龄； V2:属数； V3:种的丰度； V4:Shannon指数； V5:Simpson指数； V6：均匀度； R 值后的“* ”表示显著相关( P < 0.05)。V1:Tree age; V2:Genus number; V3:Species richness; V4:Shannon; V5:Simpson; V6:Pielou.The “*” after the R value indicates a significant correlation(P < 0.05).

在树龄和菌根状况的关系研究上，如Muleta等(2008)调查表明埃塞俄比亚西南部的小粒咖啡(Coffeaarabica) 的真菌孢子密度与树龄表现随着树龄的增加而降低。Song 等(2019) 研究表明安徽琅琊山琅琊榆(Ulmuschenmoui) 的菌根侵染率和真菌多样性随着树龄的增加而降低；然而，也有研究报道了AMF丰富度并没有随着树龄的增长而发生显著性变化(Herrmannetal., 2016)。另外，Dalli等(2020) 研究发现阿尔及利亚西部角豆(Ceratoniasiliqua)树树龄≥ 30的菌根侵染率和AMF孢子密度的数值比树龄 ≤ 10的大。目前，但国内关于树龄对菌根状况影响的研究鲜见报道，本研究表明枫香树龄在(10、 20、 50和100) 范围内的真菌多样性随着树龄的增加而降低，其原因可能与土壤肥力，尤其是土壤有机质有关。另一个原因可能是幼龄树根较老龄根系具有较发达的细根(Baddeleyetal., 2005), 幼龄根系大量薄壁细胞、发达的细胞间隙以及较小的表层阻力，更有利于被AMF侵染，形成AMF多样性。

本研究结果表明，在不同生境条件下植物的生理特征(例如年龄、生长状况和健康状况)明显会影响到AMF群落组成，尤其在植物生长早期，与Bever等(2009)的研究结果相一致。另外，RDA分析表明，枫香根际AMF群落组成与非生物因子：土壤过氧化氢酶活性、土壤有机质、土壤pH和土壤蔗糖酶活性呈显著相关(P< 0.05)，说明土壤养分也是影响枫香林土壤AMF的重要因素，这与Guo等(2013)、 Lan等(2017)、Hugoni 等(2018)的研究结果相似。任爱天等(2014) 研究发现新疆石河子绿洲区土壤质地、pH、有机质均对苜蓿(Medicagosativa)根际 AMF分布和多样性会产生一定的影响；廖楠(2016) 研究广西甘蔗(Saccharumofficinarum)根际土壤 AMF多样性时发现，在赤红壤中，土壤的 pH 对根系 AMF 物种丰富度有一定的影响。此外, 本研究结果表明土壤pH对枫香根际AMF多样性影响最大, 土壤pH与AMF种的丰度呈正相关(P< 0.05)。由此可知，AMF种的丰度受pH影响较大。但是，AMF多样性指数：属数(Genus number)、种的丰度 (SR)、Shannon指数、Simpson指数和均匀度数值在5个采样地呈显著性差异(P< 0.05)。因此，在相似的年平均温度和年平均降水量的条件下，推测枫香和地理环境对共生AMF多样性的选择起主要筛选作用，该推测结果与刘润进等(2009)、Hiiesalu等(2014)、Urbanov等(2015)、Muleta等(2008)的研究结果一致。AM 真菌与环境和宿主植物之间的关系密不可分，因此，了解非生物因子与微生物之间的这种相互关系可为揭示植物与微生物之间的互作机制提供参考，并为生产高药效、高质量的枫香提供新思路。