血小板微粒表面CD62p在缺血性脑卒中中的检测价值

胡志清，赵星鹏，刘坦

(郑州大学附属洛阳中心医院 a.检验科；b.科研科，河南 洛阳 471009)

卒中是世界范围内引起残疾的第三大原因，其中缺血性脑卒中约占所有卒中的87%[1]。缺血性脑卒中指大脑供血动脉闭塞或狭窄使脑供血不足而导致的脑组织不同程度受损，主要由动脉粥样硬化及继发血栓形成引起，而血小板在血栓形成过程中发挥着重要作用，而高血压史、血脂异常、糖尿病、吸烟、超重或肥胖等被认为是缺血性脑卒中的危险因素[2]。近年来，国内外学者深入研究了脑卒中的发病机制，如炎症反应、血液流变学、钙超载、细胞凋亡、谷氨酸的兴奋毒性等学说。近期研究表明，急性脑缺血后，表达CD62、CD63和血小板反应蛋白的血小板数目增多，在脑缺血的恢复期，仍可观察到血小板的活化现象[3]。本研究通过检测缺血性脑卒中患者、脑卒中高危因素人群和健康对照人群体内血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)表面CD62p水平，探讨其在脑卒中诊断和风险评估中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年8月至2020年8月郑州大学附属洛阳中心医院收治的30例缺血性脑卒中患者作为缺血性脑卒中组，30例具有卒中高危因素患者作为高危因素组，另选同期在郑州大学附属洛阳中心医院体检的30例正常者作为对照组。缺血性脑卒中组年龄40～75岁，平均(65.73±10.16)岁；高危因素组年龄41～78岁，平均(63.33±6.75)岁，其中14例具有单一高危因素，16例具有2项及以上高危因素；对照组年龄39～79岁，平均(63.33±4.03)岁，3组间年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1缺血性脑卒中组 (1)纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[4]的诊断标准；②经头部CT或MRI证实。(2)排除标准：①1个月内有特殊治疗史(放疗、化疗、手术及使用生物制剂)；②有肿瘤、风湿性疾病、出血及其他血栓栓塞性疾病。

1.2.2高危因素组 (1)纳入标准：主要包括高血压史、血脂异常、糖尿病、吸烟、超重或肥胖、有脑卒中家族史。①高血压、糖尿病、血脂异常的诊断参考《内科学》(8版)。高血压的诊断标准：非同日3次检查的收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mmHg，或正在服用降压药。糖尿病的诊断标准：糖尿病症状，以及任意时间血浆葡萄糖≥11.1 mmol·L-1，或空腹血糖≥7.0 mmol·L-1，或餐后2 h口服葡萄糖耐量试验血糖≥11.1 mmol·L-1，需重复检测1次才能确认。血脂异常的诊断标准：甘油三酯≥2.26 mmol·L-1，或总胆固醇≥6.22 mmol·L-1，或低密度脂蛋白胆固醇≥4.14 mmol·L-1，或高密度脂蛋白胆固醇<1.04 mmol·L-1。②吸烟：每日超过1支，且连续吸烟1 a以上(戒烟6个月以上则认为不吸烟)。③超重或肥胖：体质量指数(body mass index，BMI)≥26 kg·m-2。(2)排除标准：①1个月内有特殊治疗史(放疗、化疗、手术及使用生物制剂者)；②有肿瘤、风湿性疾病、出血及血栓栓塞性疾病等。

1.2.3对照组 健康者且无1.2.2中所描述的脑卒中高危因素。

1.3 检测方法

1.3.1试剂与仪器 流式检测试剂为BD公司生产的PE Mouse Anti-human IgG(Lot 7275972)、PE Mouse Anti-human CD62p(Lot 8274750)、FITC Mouse Anti-human CD41a(Lot 8197636)和FITC Mouse Anti-human IgG(Lot 8284569)。检测仪器为BD FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪。生化指标检测使用Hitachi 7600全自动生化分析仪及配套试剂。

1.3.2血液标本采集 采集高危因素组和对照组空腹静脉血，缺血性脑卒中组患者在入院未做任何治疗前进行静脉血采集。采用促凝静脉血1 580×g离心10 min获得血清，检测血脂和血糖水平。

1.3.3PMPs表面CD62p测定标本的制备

1.3.3.1抗体的稀释 将20 μL的PE Mouse Anti-human IgG、PE Mouse Anti-human CD62p、FITC Mouse Anti-human CD41a与FITC Mouse Anti-human IgG抗体用体积分数为50%的甘油(用0.01 mol·L-1且pH为7.4的PBS溶液稀释)稀释至2 mL。

1.3.3.2流式标本制作 获得枸橼酸钠抗凝血后即刻110×g离心10 min，获得富血小板血浆。将处理好的富血小板血浆分装至500 μL的EP管中，每管10 μL，共计2管，标记为实验管与对照管。实验管中分别加入20 μL的PE Mouse Anti-human CD62p与FITC Mouse Anti-human CD41a，对照管分别加入20 μL的PE Mouse Anti-human IgG与FITC Mouse Anti-human IgG，吹打混匀后，室温避光孵育30 min，随后每管加入500 μL的4%(体积分数)的多聚甲醛4～8 ℃固定20 min，振荡混匀后上机检测。

2 结果

2.1 3组CD62p水平缺血性脑卒中组PMPs表面CD62p阳性率高于高危因素组，高危因素组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 缺血性脑卒中组、高危因素组和对照组PMPs表面CD62p水平比较

2.2 CD62p对缺血性脑卒中的临床诊断价值对照组与高危因素组进行ROC分析，CD62p的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.869，取Youden指数(敏感性、特异性之和减1)最大点对应诊断界限值为9.22%，此时预测缺血性脑卒中高危风险的敏感性为66.7%，特异性为86.7%。高危因素组与缺血性脑卒中组进行ROC分析，CD62p对缺血性脑卒中的诊断效能高，AUC为1.000，Youden指数最大点对应的诊断界限值为29.94%。见图1。

图1 CD62p对缺血性脑卒中的临床诊断价值

3 讨论

缺血性脑卒中发生的根本原因是血小板在血管内活化引起的血管栓塞，在此研究基础上，血小板活化相关标志物成为目前缺血性脑卒中发生发展研究领域的重要研究方向，其中，PMPs是现阶段研究热点。目前多项研究认为PMPs可以作为缺血性脑卒中有前景的生物标志物之一。依据细胞来源不同，将微粒体分为血小板微粒体、内皮微粒体、白细胞微粒体等。在健康者血液中，微粒体以来自血小板的微粒体为主，内皮细胞微粒体、白细胞微粒体及其亚群数量较少[5]。PMPs是血小板受刺激活化后产生的，体内PMPs的形成、释放及水平可以反映体内血小板的活化程度，同时血小板微粒体也被认为是血管性疾病的标志物[6]。PMPs表面表达血小板膜上的多种糖蛋白，包括GPⅡb/Ⅲa、CD62p等，其中CD62p是血小板微粒表面的特异性糖蛋白，CD62p可介导血小板黏附于内皮细胞，并促进血小板中性粒细胞与血小板单核细胞的连接，激活中性粒细胞，释放多种活性酶、细胞因子等血管活性物质，损伤内皮细胞，引起基膜通透性增加、细胞外基质增生、纤溶活性下降、纤维蛋白原沉积等多种生物学效应，启动血栓形成过程。而PMPs是通过其表面的CD62p蛋白调节血小板功能的，因此，PMPs表面CD62p水平可以反映血小板的活化程度，进一步反映机体的凝血状态[7-10]。

本研究选择PMPs表面CD62p水平作为研究对象，结果显示缺血性脑卒中组PMPs表面CD62p的水平高于对照组和高危因素组，说明在卒中发生时，机体的血小板活化极度活跃，该研究结果与现有研究结果[11-12]相符合。现有研究表明健康个体外周血中存在少量PMPs，在缺血性脑卒中急性期与慢性期外周血中PMPs水平均升高[11-12]。因此，本研究进一步为现有研究结果提供数据支撑，同时PMPs表面CD62p的检测相较于PMPs水平检测更直接反映血小板的活化程度，可以作为直观指标应用于缺血性脑卒中的防控中。

目前关于缺血性脑卒中高危因素与血小板活化水平相关性的研究较少，缺少生物学指标，缺血性脑卒中的危险因素主要有高血压史、血脂异常、糖尿病等，这些危险因素均可以通过破坏血管内皮细胞来诱导血小板活化，释放出血小板微粒，有研究发现血小板表面CD62p、可溶性CD62p和PMPs水平与动脉粥样硬化的危险因素[高血压和(或)2型糖尿病和(或)血脂异常]呈正相关[13-14]。另外，长期吸烟人群血清和血小板膜上的CD62p水平也会升高[15-16]。动物实验研究表明，吸烟可造成大鼠脑动脉血管内皮细胞的损伤，且随着吸烟量增加及吸烟时间的延长，其血管内细胞的损伤程度也随之加重。而超重或肥胖也能引起血管内皮细胞功能受损，进而诱导血小板活化，分泌血小板微粒[17]。以上研究说明高危因素能够引起血小板的活化与PMPs的释放。本研究中，高危因素组与对照组相比，高危因素组PMPs表面CD62p的水平也有升高，证实了高危因素人群血小板已部分活化，也说明机体处于血栓前状态，一旦有诱导因素，脑卒中即可能发生[18]。同时，ROC曲线结果证实，PMPs表面CD62p对于缺血性脑卒中的诊断有一定价值，其作为预测脑卒中风险性的指标，也有较高的敏感度和特异度。因此，定期检测高危因素人群PMPs表面CD62p水平，通过控制血压、降脂、降糖、减肥、戒烟等消除高危因素，对脑卒中的预防具有重要意义[19]。

本研究虽然证明了高危因素组PMPs表面CD62p水平高于健康者，但还存在统计与检测指标相对较少、未说明各个高危因素与PMPs水平相关性等问题，下一步计划扩大标本量，将高危因素组人群进行细分，同时检测血浆中游离CD62p、凝血酶水平等指标，完善样本数据，为PMPs表面CD62p在临床上的应用提供数据支撑。