辣椒不同基因型辣椒素含量的变异及相关基因表达分析

庞 欣，王乙媛，沈明鑫，朱 跃

（苏州农业职业技术学院，江苏苏州 215008）

辣椒是中国种植面积最大，加工、消费功能最多的蔬菜，也是极受欢迎的的调味品[1]，同时它还具有很高的药用价值[2]。辣椒素类是辣椒的重要次生代谢物，辣椒素与二氢辣椒素是辣椒辣味的主要来源[3]。辣椒素是辣椒的主要活性成分，它不仅可以抗疲劳[4]，还具有止痛、健胃、降脂、抵御癌症等功效[2,5-6]。最近，科研工作者发现辣椒素在干细胞增殖、分化方面有一定的作用，并开始探究其中的机理[7]。因此，研究辣椒素合成途径的调控机理就显得尤为重要，但目前对这方面的研究还较少。2016 年，谢文忠[8]把通过克隆得到的属于R2R3-MYB 转录因子家族的MYB 转录因子的基因命名为Ccmyb，并推测这个基因是MYB 转录因子的结合位点，通过一系列作用，激活辣椒素合成酶基因的表达，从而调控辣椒素的合成；周欣[9]通过对MYB 转录因子克隆，并对其功能进行分析，推测辣椒素含量的合成可能受到多个转录因子的调控。2016 年，朱张生等[10]定位到了Capsaicinoid1 一个数量性状位点，这个位点所在的染色体区域由6 个MYB 转录因子和2 个假基因构成，包括转录因子Capana07g001604。王红娟等[11]通过对2 种不同辣度的辣椒的转录组分析，鉴定出了可能参与辣椒素含量合成调控的转录因子MYB。2020年，Jin Wang 等[12]对辣椒的R2R3-MYB 全基因组进行了鉴定，发现MYB 转录因子在辣椒素合成过程中起关键作用，并推测有6 个候选CaR2R3-MYB 基因参与调控辣椒素和二氢辣椒素的合成，Capana07g001604正是参与辣椒素生物合成的候选CaR2R3-MYB 基因。

目前，关于辣椒素含量合成的转录因子的研究大多集中于MYB31 上，且有研究表明是MYB 转录因子MYB31 的自然变异导致了辣椒素的形成，且特异表达位点是在胎座中[10,13]。但关于MYB 转录因子基因簇的其他基因的研究并不多。因此，为了明确转录因子Capana07g001604 是否对辣椒素含量的合成有影响，以4 个辣椒株系L0125、L2541、L3025、L4589 为试验材料，来研究辣椒素的含量变化与Capana07g001604基因表达的关系，为之后进一步研究MYB 转录因子簇在辣椒含量合成中所起的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣椒株系：L0125、L2541、L3025、L4589。

1.2 试验设计

分别将4 个辣椒株系等量的种子播种于装有湿润育苗基质的育苗盘内，每个孔播种2 粒，并置于培养箱内育苗，当幼苗长至5～6 片真叶时，将其移栽至塑料大棚内进行定植和管理。

待植株长出花苞后，分别采取株系L4589 的0.25cm、0.50cm、0.70cm、0.80cm、1.00cm、1.20cm、1.45cm 的花，生长至10d、15d、20d、25d、30d、35d、40d、45d、50d、55d、60d 的果实，发育至20d、25d、30d、35d、40d、45d、50d、55d、60d 种子与胎座（由于果实产生种子的初期10d、15d 内，果实内的种子与胎盘还未分开，无法分清究竟是种子还是胎盘，故此次试验不计入），用RT-PCR 法测定转录因子Capana07g001604 表达情况。

待辣椒开花结束后，分别采取4 个辣椒株系L0125、L2541、L3025、L4589 生长至10d、20d、30d、40d、50d、60d 的果实，用HPLC 法测定辣椒果实中辣椒素与二氢辣椒素的含量。

设置3 个重复，每个重复各取5 个样品。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 辣椒素与二氢辣椒素的提取与测定。分别取4 个株系6 个时期辣椒果实中的胎座组织，由于高温会影响辣椒素类物质的稳定性[14]，故用HPLC 法测定冻干胎座组织中辣椒素与二氢辣椒素的含量，具体方法参考曹莉等[15]HPLC 法。

1.3.2 Capana07g001604 表达含量的测定。使用RNAsimple Total RNA Kit 总RNA 提取试剂盒（Tiangen），依据说明书操作，提取株系L4589 生长发育不同大小的花和不同时期的果实、种子、胎座的总RNA；再用FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一链合成试剂盒（Tiangen）进行反转录。接着对所转录好的cDNA 用RT-PCR 法进行扩增分析。使用CaREV05（CA00g79660）作为内参基因进行基因表达分析。

1.4 数据分析

利用Microsft Office Excel 2010 整理数据，进行误差分析，并用Microsft Office Excel 2010 绘制成图。

2 结果及分析

2.1 不同辣椒株系不同时期冻干胎盘组织中辣椒素与二氢辣椒素含量变化

4 个辣椒株系L0125、L2541、L3025、L4589 果实发育过程中胎座组织的辣椒素与二氢辣椒素含量变化趋势是相同的，均呈先增加后减少的趋势，且都在40d 时两者的含量达到最高，第60d 时两者的含量仍要高于第20d 的含量（图1、图2），但在第10d 时并未检测到辣椒素与二氢辣椒素的含量，这说明辣椒素类物质在胎座中的合成是从第10d 之后开始的，大量的研究表明，辣椒素类物质在胎座中是从15d 左右开始的，这与之前科研工作者的研究发现是一致的，都是先上升至高峰再下降，与辣椒果实的生理变化有一定的联系[16]。故辣椒素类的合成表达具有明显的阶段特异性。每个株系的辣椒素含量都明显高于二氢辣椒素的含量，在这4 个株系中，L4589 的辣椒素含量要明显高于其他株系，说明辣椒素在株系L4589 中的含量更高，相较其他3 个株系，果实要更辣一些，即转录因子转录水平更高，合成的辣椒素类物质更多。

图1 不同辣椒株系冻干胎盘组织中不同果实发育时期辣椒素含量

图2 不同辣椒株系冻干胎盘组织中不同果实发育时期二氢辣椒素含量

2.2 转录因子Capana07g001604 在花果实、种子、胎座不同时间表达含量的变化

由图3 可知，转录因子Capana07g001604 的表达量并未呈现规律性的变化，在果实和种子中均是前期表达量较高，后期表达水平明显降低，而在胎座中整体上随着胎座生长发育的变化，表达水平是逐渐提高的；转录因子Capana07g001604 在果实中的表达水平最高，在种子中的表达水平最低，且同一时期在果实中的表达含量整体上要高于在种子与胎座中的表达含量，并未在胎座中特异性表达，这与转录因子MYB31 的作用机理是不同的[10]。

图3 实时荧光定量PCR 分析转录因子Capana07g001604 在果实、种子、胎座生长发育过程中不同时间段的表达情况

3 结论与讨论

辣椒素类物质是辣椒特有的次生代谢物，是评判辣椒品质的重要指标，在医药等方面也有广泛的前景。辣椒辣味的强弱是数量性状的遗传[17-18]，但会受多方面因素的影响，基因、环境、辣椒自身激素调节等都会影响到辣椒素类物质的含量[19-20]。品种不同，辣椒素与二氢辣椒素的含量有很大的差异。在试验中，选用辣椒的4 个株系L0125、L2541、L3025、L4589 作为研究材料，测定其胎座中辣椒素与二氢辣椒素的含量，并以L4589 作为研究材料，来测定转录因子Capana07g001604 在果实、种子、胎座不同发育时间的表达情况。结果表明不同株系的辣椒素与二氢辣椒素在胎座中的含量是随着胎座的生长发育在不断变化的，总体趋势是先升高后降低，两者均在40d 时含量达到最高，当胎座初发育至10d 时，并未检测到辣椒素与二氢辣椒素的含量，20d 时均可检测到辣椒素与二氢辣椒素的存在，且辣椒素的含量要高于二氢辣椒素的含量。转录因子Capana07g001604 在株系L4589 果实、种子、胎座中的表达水平是不同的，通过比较可以发现，该基因总体上在果实中的表达水平要高于其它部位，表达情况并未出现很明显的规律性变化。这可能与转录因子作用的机理不同有关，如备受关注的转录因子MYB31 只在胎座中特异性表达，且受发育阶段的调控[10]。

目前，关于辣椒中辣椒素含量的转录调控机理的研究越来越受到科研人员的重视。2021 年，赫卫等[21]对辣椒R2R3-MYB 转录因子进行了全基因组鉴定，发现转录因子Capana07g001604 含有2 个内含子，位于R2 的14-61 区域，R3 的67-112 区域，并依据进化树Capana07g001603/Capana07g001604 序列相似性达到了82.45%，从而推测辣椒MYB 家族在进化过程中经历了串联重复事件[21]。试验对Capana07g001604 在辣椒果实、种子、胎座中的表达情况进行了分析，但其究竟是如何发挥作用的还尚不清晰，有待进一步探索研究。