杜氏盐藻促生菌对小白菜耐盐性的影响

2021-12-01崔红利许文鑫朱晓丽段露露刘正一任承刚杨剑超唐涛李润植

山西农业大学学报(自然科学版) 2021年5期

崔红利，许文鑫，朱晓丽，段露露，刘正一，任承刚，杨剑超，唐涛，李润植*

（1. 山西农业大学农学院分子农业与生物能源研究所，山西太谷 030801；2. 山西农业大学农学院省部共建有机旱作农业国家重点实验室（筹），山西太原 030031；3. 山西农业大学植物保护学院，山西太谷 030801；4. 中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台 264003；5. 烟台市农业科学研究院，山东烟台 265500；6. 中国科学院上海高等研究院，上海 201210）

土壤盐碱化修复及盐碱地资源高效利用已经成为世界性难题。土壤中盐浓度过高会诱发盐胁迫逆境，通常表现为降低植物吸水率、抑制细胞分裂、分化与植物生长，同时，还会产生过量活性氧、积累大量丙二醛，从而导致细胞质膜透性增加、光合作用减弱、蛋白质合成受阻及植物代谢功能紊乱等，最终加速细胞衰老和程序性死亡，严重影响农作物的生长和产量［1～3］。因此，改良盐碱化土壤、解析植物耐盐机制、提高作物耐盐性及培育耐盐新品种已经成为该领域的研究热点，而添加外源物质诱导植物耐盐性则发展成为一项简单且高效的方法。

利用微生物与植物之间互作提高植物耐盐性备受关注［4～6］。植物根际促生菌（Plant growth-pro⁃moting rhizobacteri，PGPR）可以通过刺激植物产生多种激素、调控植物体内离子平衡、提高植物渗透调节能力、保护光合作用、提升水分利用率、激活植物抗氧化系统、调整植物代谢过程及诱导耐盐相关基因的表达等多种方式提高植物耐盐性［6～10］，PGPR 本身就可以合成与分泌胞外多糖，改善根际土壤理化性质、增强植物对水分和肥料的利用率、促进植物在盐碱地中的生长与产量［11］。目前，绝大多数的PGPR 是从植物根系中筛选与鉴定获得，利用特殊生境的微生物资源来开发植物根际促生菌的研究较少。

杜氏盐藻是一类生长于盐湖生境的单细胞真核藻类，具有耐盐性强、抗逆性强及富含胡萝卜素等优势。藻际微生物（Phycosphere microorgan⁃ism）是一类共生、寄生或黏附于藻细胞的一大类微生物群体。其与宿主藻细胞之间的关系极为复杂，藻-菌即互利共生，又相互拮抗［12］。大量文献表明：藻-菌共生体系能有效促进藻细胞生长、提高生物量、增强营养盐的吸收、改善藻细胞代谢过程，尤其是提高色素和油脂的积累［13～16］。我们课题组前期从山西运城盐湖的一株杜氏盐藻（Du⁃naliella salina）中分离并获得5 株共生菌，包括2 株涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia）、2 株盐单胞菌（Halomonas）和1 株海杆菌（Marinobacter）。5 株共生菌株均能不同程度促进杜氏盐藻的生长，经初步筛选，其中一株盐单胞菌株B3 效果最好［17］，但其在提高非宿主生物耐盐性方面的研究尚未进行。本研究以促生作用明显的盐单胞菌B3 为出发菌株，基于水培体系，从发芽、生长、抗氧化系统和渗透调节等方面探讨了其对盐胁迫下小白菜耐盐性的影响，旨在揭示盐单胞菌B3 在提高植物耐盐性方面的新功能及其作用机制，为研制增强植物耐盐性的微生物菌剂提供理论依据。

1 材料和方法

1. 1 试验材料

小白菜为“奶油四季小白菜”（Brassica chinen⁃sis）购自河北沧州青县良达盛农技术推广中心，以下简称为小白菜。

目的菌株为从杜氏盐藻分离获得的盐单胞菌株B3（Halomonas），保存于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌液制备

将盐单胞菌B3 活化后以5% 的接种量接入含5% 氯化钠的LB 液体培养基，置于28℃细菌培养箱中摇瓶（180 r·min-1）培养48 h，至指数生长期，取菌液离心（8 000 r·min-1）10 min，弃上清，用无菌水冲洗去除残留培养基成分，之后用无菌水将OD600值调至0. 7，置于4 ℃冰箱保存。

1. 2. 2 试验方法

选取籽粒饱满、大小均匀一致的小白菜种子250粒，用1% 的次氯酸钠溶液浸泡10 min 消毒，蒸馏水洗净后备用。发芽床的制备：选择无菌培养皿进行实验，将预处理的种子放置于经高温灭菌的铺有两层滤纸的培养皿中。每组10粒一个平行，重复3次。试验共设4大组，分别为无菌水、无菌水+菌液、不同浓度NaCl（100、150、200 mmol·L-1）、不同浓度NaCl（100、150、200 mmol·L-1）+菌液。

盐单胞菌B3 添加方式为浇灌方式，每次在种子或根际周围浇2 mL 预处理的菌液，每天1 次；对照处理组添加等量无菌水。将培养皿置于25 ℃培养箱中暗培养5 d，每天记录发芽情况。将发芽之后的小白菜幼苗转移至育苗棉上进一步培养，待长出两片子叶后移栽至25 cm×35 cm 的水培营养盆中，每盆10 株，漂浮板上间距7 cm，行距8 cm，培养条件为室温25 ℃，14 h/10 h 光暗周期，每2 天更换1 次营养液（1/2 Hoagland），25 d 后采收，进行各项生长及生理指标的检测。试验设计见表1。

表1 盐胁迫与促生菌添加方案Table 1 Different treatments of salt stress and bacteria addition

1. 2. 3 指标测定与方法

每天统计种子发芽数（以胚芽长至种子长度的1/2 为标准），培养至第5 天计算发芽率，并在第3 天计算发芽势。

式中，Gt为第t 日种子的发芽数；N 为供试种子数。

将收获期的小白菜幼苗用滤纸将其根部和叶片部分营养液和水分吸干，进行称重测定鲜重。参考Fryer 等［18］方法，在450 nm 和532 nm 处测定其吸光值，计算丙二醛（MDA）含量。配置不同浓度的脯氨酸标准品，根据520 nm 波长下吸光值绘制标准曲线，通过脯氨酸标准曲线计算各试验组小白菜中脯氨酸含量。抗氧化酶活测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，包括超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-1 法）A001-3，过氧化物酶（POD）测定试剂盒（测植物）A084-3-1，过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（可见光法），具体操作过程参照试剂盒说明书进行。

1. 3 统计分析

采用SPSS 软件对数据进行处理及统计分析，采用Origin9 软件作图。具体分析方法如下：首先，比较对照组（未添加盐单胞菌B3）在四个条件下的显著性分析（图中4 组之间的比较，采用小写字母a，b，c，d 灰色字体标记，P＜0. 05）；其次，比较试验组（加盐单胞菌B3）在4 个条件下的显著性分析（图中4 组之间的比较，采用小写字母a，b，c，d 黑色字体标记，P＜0. 05）；最后，同一个盐浓度胁迫处理条件下，实验组与对照组之间的显著性分析（图中2 组之间的比较，采用*和**黑色字体标记，*代表P＜0. 05，**代表P＜0. 01）。

2 结果与分析

2. 1 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜萌发的影响

种子萌发5 d 内，每天统计各实验组小白菜种子萌发情况，并计算发芽率（第5 d）及发芽势（第3 d）。结果如图1 所示，在正常培养条件下，添加盐单胞菌B3 能促进其发芽率，由原来的72. 4% 提升到80. 9%。在盐胁迫条件下，与正常培养相比，盐胁迫均能抑制小白菜的发芽，且效应与盐浓度呈现正相关。当NaCl 浓度达到200 mmol·L-1时，其发芽率降低到17. 5%，说明盐胁迫严重抑制了小白菜的萌发。在不同程度盐胁迫条件下，添加盐单胞菌B3 均能缓解盐胁迫对种子萌发的抑制作用，提高小白菜种子发芽率，且随着盐浓度升高，提高程度越明显。当NaCl 浓度达到200 mmol·L-1时，添加盐单胞菌B3 使小白菜发芽率由11. 7% 提升到26. 8%。

图1 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜发芽率的影响Fig.1 Effect of Halomonas sp. B3 addition on germination rate of Brassica chinensis seeds under different salt stress

发芽势的变化趋势与发芽率的高度一致（图2）。在正常培养条件下，添加盐单胞菌B3 能促进小白菜的发芽势，由原来的59. 5% 提升到73. 4%。在盐胁迫（0～200 mmol·L-1）条件下，小白菜发芽率下降的同时，发芽势同样显著降低，当NaCl 浓度为150、200 mmol·L-1时，发芽势分别降低到32. 4% 和12. 3%，是对照组的54. 5% 和20. 7%。不同程度盐胁迫条件下，添加盐单胞菌B3均能明显提高小白菜种子发芽势。当NaCl 浓度达到200 mmol·L-1时，添加盐单胞菌使小白菜发芽势由12. 3% 提升到23. 6%，提升效率显著（P＜0. 01）。

图2 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜发芽势的影响Fig.2 Effect of Halomonas sp. B3 addition on germination poten⁃tial of Brassica chinensis seeds under different salt stress

2. 2 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜鲜重的影响

测定了小白菜幼苗鲜重，结果表明，正常培养条件下，添加盐单胞菌B3 能轻微促进小白菜的生长（图3），从而提高鲜重，达到11. 8 g·株-1。盐胁迫严重抑制小白菜幼苗的生长，并且抑制效应伴随着NaCl 浓度增加而增强，当NaCl 浓度从100 mmol·L-1上升到200 mmol·L-1时，鲜重显著下降，由7. 4 g·株-1下降到2. 6 g·株-1。在盐胁迫条件下，添加盐单胞菌B3 对小白菜幼苗的生长产生不同的影响。当NaCl 浓度为100 mmol·L-1时，其作用效果不显著，但在高NaCl 浓度下，小白菜幼苗生长的抑制作用得到减缓，具体来讲，当NaCl 浓度为150 mmol·L-1和200 mmol·L-1时，添加促生菌B3 后，小白菜鲜重分别达到8. 9 g·株-1、4. 6 g·株-1，提高19. 5%、83. 5%。尽管鲜重还是远低于对照，但表明在高盐胁迫的条件下，促生菌B3 通过缓解盐胁迫对小白菜幼苗生长的抑制作用，从而不同程度促进幼苗生长。

图3 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜鲜重的影响Fig.3 Effect of Halomonas sp. B3 addition on fresh weight of Bras⁃sica chinensis under different salt stress

2. 3 添加盐单胞菌B3 对NaCl 胁迫下小白菜丙二醛（MDA）含量的影响

当植物受到盐胁迫时，细胞膜脂会受到不同程度的氧化损伤从而导致丙二醛（MDA）含量的提高，因此MDA 含量能反映生物体受到氧化损伤的程度。伴随着盐胁迫程度的增加，小白菜幼苗MDA 含量逐渐升高，当NaCl浓度达到200 mmol·L-1时，体内MDA 含量达到最高值（图4），为1. 19 μmol·g-1。正常培养条件下，添加盐单胞菌B3 即可显著降低小白菜体内的MDA 含量，当盐浓度不断增加，MDA 含量的降低幅度逐渐增大，盐浓度为150、200 mmol·L-1时，MDA 含量分别为0. 82、1. 01 μmol·g-1，与不添加盐单胞菌B3 的对照相比，分别下降13. 7%、15. 1%。

图4 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜MDA 含量的影响Fig.4 Effect of Halomonas sp. B3 addition on MDA content of Brassica chinensis under different salt stress

2. 4 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜抗氧化酶活性的影响

植物应对氧化损伤的有效途径之一是激活抗氧化系统。随着NaCl 浓度的升高，3 种抗氧化系统的酶活在盐胁迫条件下的变化趋势基本一致，呈现先升高再下降的趋势。低浓度NaCl（100 mmol·L-1）诱导下，CAT、POD 及SOD 的酶活达到最高值，分别为120. 4、37. 5、215. 5 U·g-1。在正常培养条件下及低浓度NaCl 诱导下，添加盐单胞菌B3 对抗氧化酶活影响并不显著（图5）。当NaCl 浓度达到200 mmol·L-1时，CAT、POD 及SOD 的酶活分别下降至20. 4、23. 6、147. 5 U·g-1，分别为原始的16. 9%、62. 9%、68. 4%，上述结果表明高浓度的盐胁迫严重抑制这3 种抗氧化酶的活力，尤其是CAT 活性。在盐胁迫条件下，添加盐单胞菌B3 均能不同程度提高这3 种抗氧化系统的酶活力，变化趋势基本一致。当盐浓度为200 mmol·L-1时，CAT、POD 及SOD 活性分别提升到60. 2、29. 4、174. 6 U·g-1，与未添加盐单胞菌B3 的处理组相比，分别提升了195. 1%、24. 6%、18. 4%，其中CAT 的酶活提升效果最为显著。

2. 5 添加盐单胞菌B3 对盐胁迫下小白菜脯氨酸（Pro）含量的影响

在盐胁迫条件下，植物通过积累脯氨酸等渗透保护物质来减轻盐胁迫对植物造成的渗透胁迫［9］。在盐胁迫条件下，Pro 含量变化趋势为迅速升高然后缓慢下降（图6），当NaCl 浓度达到100 mmol·L-1时，Pro 含量达到最大值0. 52 mg·g-1，当NaCl 浓度达到200 mmol·L-1时，Pro 含量显著降低为0. 12 mg·g-1。高浓度盐（200 mmol·L-1）胁迫下，Pro 含量虽然有所下降，但仍然高于无盐胁迫的处理组。在正常培养条件下，添加盐单胞菌B3便可促进小白菜幼苗中Pro 含量。而盐胁迫的条件下，添加盐单胞菌B3 能进一步显著提升小白菜幼苗中的Pro 含量，当NaCl 浓度达到150、200 mmol·L-1时，添加组的Pro 含量分别达到0. 31、0. 19 mg·g-1，为非添加组的1. 41 倍和1. 58 倍。

3 讨论

盐胁迫作为农作物主要非生物胁迫之一，会对作物的产量和品质产生严重影响。诱导并激活植物自身抗盐系统是提高植物耐盐性的有力途径，常见的诱导剂包括化学类物质和生物活体细胞。近年来，特殊生境的微生物资源尤其是耐盐菌株在提高植物耐盐性方面的研究受到越来越多的重视。例如从玉米根际［19］、盐生植物根际［20］、碱蓬根际［21］及盐碱地［22～25］等分离鉴定的促生菌均可不同程度增强作物的耐盐性。本论文以分离得到的杜氏盐藻促生菌为研究对象，考察其增强植物耐盐性的效果并探索其作用机制。

通常低盐浓度会进种子萌发，但随着盐浓度的增加，发芽率和活力指数均降低，过高的盐浓度抑制种子的萌发［3～6］。赵满兴等研究发现，草木樨和碱茅种子的发芽率随着盐浓度的升高呈先上升后下降的趋势［26］。在本研究中盐胁迫并未发现促进种子萌发的现象，可能的原因是试验中选择的100 mmol·L-1的盐浓度过高，已经超出促进萌发的范围或者与种子特异性相关。本研究中盐胁迫严重抑制小白菜的生长，最终导致小白菜的发芽率和鲜重急剧下降。添加盐单胞菌B3 能一定程度缓解盐胁迫对小白菜幼苗生长的抑制作用，尤其是高盐浓度下，有利于恢复生长提高鲜重。这一现象与前人研究结果一致，例如从滨海盐碱地根际土壤样品中分离鉴定的根际促生芽胞杆菌T1-8和T4-9 均能缓解植物盐胁迫伤害并能提高玉米的产量［23］。本研究还发现在正常培养条件下，添加盐单胞菌B3 便可提高发芽率和发芽势，进一步促进生长，最终增加产量。相关文献研究表明，在正常条件下，将耐盐嗜根考克氏菌Y1 定殖在玉米幼苗根际能有效促进株高和根长、提高叶绿素含量及降低MDA 的含量［19］。在150 mmol·L-1的Na⁃Cl 浓度下，添加耐盐促生菌株Nesterenkonia rhi⁃zosphaera可以使小麦株高、根长及根鲜重显著增加，增长率分别为9. 4%、27. 2%、150. 1%［25］。

植物在盐胁迫下通常会积累过量的活性氧自由基，从而破坏了活性氧的产生与消除之间的动态平衡，引起不同程度的细胞膜脂质氧化损伤，积累大量的MDA，使得细胞质膜通透性增大，最终影响细胞多种生理功能［3～6］。本研究发现在盐胁迫下，小白菜幼苗中MDA 含量呈现增加趋势，并与盐浓度呈正相关性，而添加盐单胞菌B3 能降低MDA 含量。在盐胁迫下，添加耐盐嗜根考克氏菌Y1 使玉米幼苗中CAT 活性提高了0. 9 倍左右，而MDA 含量降低了0. 34 倍左右［19］。在150 mmol·L-1的NaCl 浓度下，添加耐盐促生菌株Nesterenko⁃nia rhizosphaera使得小麦幼苗根部MDA 含量显著降低［25］。

植物体内活性氧自由基含量始终处于动态平衡，主要归功于自身强大的活性氧自由基清除系统，主要包括抗氧化酶系统和抗氧化物质［3～10］。尽管植物在受到盐胁迫等刺激条件能够启动自身的酶系统来抵御不良环境，但也仅限于一定的范围内，当盐浓度过大时，抗氧化系统酶活性下降，从而对植物造成伤害［3～10］。研究表明，在盐胁迫条件下，马铃薯试管苗的CAT 和SOD 活性显著上调，在一定程度上缓解了盐胁迫伤害［27］。本研究中发现类似的结果，100 mmol·L-1的NaCl 溶液能提高抗氧化酶的活性，但盐浓度进一步增加时，抗氧化酶活性逐渐降低。此外，本研究结果表明在高盐胁迫条件下，盐单胞菌B3 能进一步提高小白菜的抗氧化酶活性，尤其是CAT 活性，这一作用效果与绝大多数PGPR 诱导植物产生抗活性氧酶类结果一致［9，10］。Kim 等发现盐胁迫下绿脓假单胞菌（Enterobacter sp.EJ01）使得拟南芥中APX 活性提高11 倍［28］。与非添加PGPR 植物相比，解淀粉芽孢杆菌SQR9 使得盐胁迫中玉米的POD、CAT和GSH 酶活性显著升高［29］。Kumari 等研究发现假单胞菌AK-1（Pseudomonas sp.strain AK-1）和芽孢杆菌SJ-5（Bacillus sp.strain SJ-5）通过增强脂氧合酶（LOX）和过氧化物酶（POD）活性提高大豆耐盐性［30］。 Nautiyal 等发现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensNBRISN13）使得盐胁迫下水稻中的CAT 活性提高1. 5 倍［31］。在盐胁迫下，小麦中添加促生耐盐菌株Nesterenkonia rhi⁃zosphaera显著提升SOD、POD、CAT 及Pro 含量［25］。尽管PGPR 或促生菌增强植物产生抗氧化酶活性的具体机理还不清楚，但不难推测在一定程度上可以通过诱导植物抗氧化酶活性增加植物耐盐性［9，10］。

在盐胁迫条件下，根际周围渗透势较低，对植物造成渗透胁迫。植物通过积累脯氨酸、可溶性糖、海藻糖、甜菜碱等渗透保护物质，以减轻盐胁迫对植物造成的渗透压危害［9，10］。研究表明，在一定的盐浓度下，植物体内Pro 积累与胁迫压力呈现正相关性［32］，同时PGPR 可通过促进植物中Pro 的积累来增加植物对盐的耐受性［9，10］。本研究中发现，盐胁迫下，不添加盐单胞菌B3，小白菜体内Pro含量仍显著升高，在100 mmol·L-1的NaCl 浓度时达到顶峰；此时，添加盐单胞菌B3，小白菜的Pro含量会进一步增加。这一结果与之前发表结果高度一致，Bharti 等发现盐胁迫下，无论接菌PGPR与否，野薄荷叶片中的Pro 含量均呈上升的趋势，但PGPR 接菌组表现出更高的Pro 水平［33］。类似的研究结果同样表现在添加解淀粉芽孢杆菌（Ba⁃cillus amyloliquefaciensNBRISN13）的水稻中、添加PGPR 的大豆中及在小麦根际定植PGPR 试验中［31～33］。PGPR 或促生菌B3 接菌后使植物叶片中Pro 含量增加可能与调控Pro 合成酶基因表达上调有关，因为在盐胁迫条件下，绿脓假单胞菌（En⁃terobacter sp.EJ01）使得拟南芥叶片中与Pro 合成相关基因P5CS1 和P5CS2 均上调表达［28］。