牦牛与犏牛睾丸组织转录组、蛋白组比较研究进展

曹梦丽 宋仁德 李吉叶 郭宪*

（1，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省牦牛繁育工程重点实验室 730050；2，青海省玉树州动物疫病预防控制中心 815000；3，青海省大通种牛场 810102）

牦牛（Bos Grunniens）属于哺乳纲偶蹄目牛科牛属，是青藏高原及其毗邻地区的主导牛种，其抗逆性强，能极好的适应高原的恶劣环境。可为当地牧民提供肉、奶、毛、役力、燃料等生活必需品，是高寒地区畜牧经济中宝贵的遗传资源，具有不可替代的地位，被誉为“高原之舟”[1]。犏牛是牦牛与黄牛的杂交后代，具有明显的杂种优势[2]，既对高海拔、低气压、低温等恶劣环境具有较强适应性，又能适应海拔较低、气温较高的地区，同时乳、肉生产能力、役用能力均优于牦牛。但由于物种间存在生殖隔离，使得犏牛雄性不育，极大阻碍了犏牛优良性状的稳定遗传，所以，研究其不育机理具有重要的理论和现实意义。目前，关于牦牛、犏牛睾丸组织的相关研究已成为牦牛改良和提高牦牛种用性能的研究热点，本文对近8 年来关于牦牛与犏牛睾丸组织转录组及蛋白组的比较研究进行归纳总结，旨在为提高牦牛种用性能和犏牛雄性不育研究提供基础资料。

1 转录组比较研究

1.1 转录组学主要研究方法

转录组学是指生物体某一生理条件下细胞或组织内表达的基因的总和，通过转录组分析，基因的结构和功能可在整体水平上进行研究以发现所涉及的特定生物学过程。随着组学的快速发展，基因芯片技术、基因表达序列分析技术及大规模平行测序技术等转录组研究方法已被转录组测序技术替代。以Sanger 测序法为代表的笫一代测序技术主要特点是准确率高达99.999%，但读长（Reads）长度仅为700～900bp，设备运行时间短，适用于通量要求低的快速研究项目，一个反映仅能得到一条读长，且大规模测序成本较高，一般适用于少量样本的小规模测序[3]；第二代测序技术主要有Roche 公司的454 技术、illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的SOLID 技术，为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，读长短，但reads 数量巨大，适合用作表达定量，且单条序列成本非常低廉，适用于大规模高通量的测序需求，现在仍是科研市场的主力平台[3]；第三代测序技术以PacBio 公司的SMRT 和Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术主流，该技术能在单核苷酸水平上检测物种的整体转录活动，并且可以识别和量化剪接类型并进行碱基修饰检测，具有操作步骤简单、通量高，成本低，灵敏度高等优点。RNA-seq 可直接分析生物体的整个转录组，也可用于未知的基因组序列分析，得到广泛应用。近年研究人员通过RNA-seq 比较牦牛与犏牛睾丸组织转录组差异，为更好地了解犏牛生精障碍的原因，为揭示犏牛雄性不育机理提供了基础信息。

1.2 在牦牛犏牛科学研究中的应用

1.2.1 编码RNA

曾贤斌[4]采集牦牛和犏牛（各5 头）个体的睾丸组织，制成2 组睾丸组织混合样，用RNA-Seq 测序技术对其进行测序和比较分析，研究表明，牦牛、犏牛睾丸中分别有18529 和17784 个基因表达，犏牛睾丸组织中表达显著上调基因有5000个，显著下调基因有4089 个；其睾酮合成的相关基因和抑制素基因表达均显著上调；与性染色体间的联会复合体数量有关的Syce3、Fkbp6、Dmrt7 等基因表达极显著下调，参与双链断裂和同源修复过程的Spo11、Dmc1 基因表达下调，参与高度浓缩细胞核的相关基因，尤其是Tnp2、Hmgb4 和H1fnt 等几乎不表达，调控基因Crem、GRTH/DDX25 等极显著下调表达；p53、TNF-α、Trail、Bmp8b、Bax、Caspase-3、Caspase-6 和Caspase-7 等凋亡相关基因表达均显著上调，而抑凋亡基因survivin、Bcl-2 等显著下调。由此可见，犏牛睾丸组织中的高表达基因大多参与蛋白合成及细胞凋亡活动，而参与精子生成的基因低表达或不表达。

杨芳[5]基于RNA-Seq 技术对12 月龄的牦牛和犏牛（各3头）个体的2 份睾丸组织样进行测序和比较分析，结果显示：共得到2960 个差异表达基因，犏牛睾丸组织样中679 个基因表达上调，2281 个基因表达下调；GO 富集分析差异表达基因发现了与精子发生相关的大量基因下调，与减数分裂相关基因CDKN2C、CYP26A1、OVOL1、GGN、MAK、INSL6、RNF212、TSSK1B、TSSK2、TSSK6 下调使减数分裂过程中精子发生阻滞加剧，与精子结构组分相关基因PRM2、ODF3 下调，导致精子形态异常；PATHWAY 富集分析差异表达基因Wnt/β-catenin 参与的信号通路中Wnt3a、PP2A、TCF/LEF-1 等基因的下调导致犏牛精原干细胞分化受阻。该研究从精原干细胞分化、精子发生及精子形态结构方面阐明犏牛雄性不育的机制。

Wu 等[6]利用高通量测序技术对12 月龄牦牛和犏牛（各3头）个体睾丸组织转录组进行了比较分析，结果表明，共鉴定出差异表达6477 个，其中2919 个上调，3558 个下调，大多数差异表达基因与有丝分裂和细胞周期进程有关，参与胶原纤维组装、细胞黏附和细胞外基质相互作用的基因上调可能阻碍了精细胞从基底部向管腔的移动。

上述研究探究了牦牛、犏牛睾丸组织编码RNA 表达差异，对与激素调节、精子发生、精原细胞分化及细胞凋亡相关基因进行了分析，通过相关分析得出犏牛精子发生阻滞开始于精原细胞分化阶段，减数分裂阶段加强，精细胞在移动中受阻，后期精子形态及结构异常。为揭示犏牛雄性不育机理提供了基础资料。

1.2.2 非编码RNA

廖珂[7]采集牦牛、普通牛和犏牛（各3 头）成年个体的睾丸组织构建miRNA 文库构建并测序，结果表明，3 个文库中共有580 个miRNA，三者均表达的有439 个，牦牛、普通牛、犏牛差异表达分别是9、10、69 个；犏牛与牦牛文库相比，表达极显著上调和下调的分别有312 个、11 个，与普通牛文库相比，表达极显著上调和下调分别是321 个、8 个；犏牛睾丸组织中表达量较高的miRNA（bat-miR-125a、bat-miR-125b、bat-miR-26a、bat-miR-26b）调控靶基因涉及细胞凋亡机制，可能与其精子发生阻滞相关；差异表达miRNA 的靶基因主要参与了4 种富集通路，分别是细胞凋亡信号通路、促性腺激素释放激素受体通路、Wnt 信号通路以及转化生长因子-β 信号通路。

徐传飞[8]通过比较分析12 月龄的牦牛和犏牛（各3 头）个体的睾丸组织miRNA 文库的差异发现了已知的50 个miRNA差异表达显著，上调和下调分别是11 个、39 个、11 个新的miRNA 差异表达显著，上调和下调分别是8 个、3 个，其中miR-19b-3p、miR-592、miR-135a、miR-378 和miR-184 参与精原干细胞自我更新及分化过程，miR-34c、miR-449a 参与减数分裂起始过程；确定了13 个差异表达的已知miRNA 的50个假定靶标和6 个差异表达的新miRNA 的30 个假定靶标，发现差异表达miRNA 靶基因主要富集通路是G 蛋白偶联受体信号通路及核糖体结构成分。

Wang 等[9]等利用高通量测序技术对牦牛、普通牛和犏牛各3 头成年个体睾丸组织的miRNAs 和piRNAs 进行了分析，得到普通牛和犏牛、普通牛、牦牛以及牦牛和犏牛的差异表达miRNA 分别为119 个、14 个、6 个，差异表达piRNA 分别是873 个、1065 个、1158 个，提示在犏牛中非编码RNA 的表达调控可能与其精子发生有一定关联。

伍仕鑫[10]对（12±1）月龄的牦牛和犏牛各3 头个体的睾丸组织进行了转录组测序，筛选出604 个差异表达的lncRNA，在犏牛睾丸组织中显著性高表达和低表达分别是135 个、469个；差异表达lncRNA 的靶基因主要参与犏牛生精分裂的起始、细胞周期进程、DNA 复制、同源重组、细胞内吞、生长、分化及凋亡等信号通路及生物学过程，其中PCNA、PPP2R5C、CDK1、BRCA1、RPA2、CLSPN、CCNB1、TEX14 和CDC45 等大量靶基因参与有丝分裂细胞进程，在犏牛中下调表达。

阿果约达等[11]等采用RNA-Seq 测序技术对3～4 岁的牦牛（3 头）和犏牛（3 头）的睾丸组织进行了转录组测序，结果表明，分别得牦牛、犏牛lncRNA 转录本20363 个、24133 个，筛选出6178 个显著差异lncRNA，与牦牛相比，犏牛睾丸组织上调和下调分别是2470 个、3708 个；筛选得到差异显著lncRNA 的候选靶基因2676 个，主要富集通路包括轴突指导、内吞、Hedgehog 等信号通路，一些lncRNA 介导的靶基因PTGDS、IGF2、MEST、GLIS3、NOTCH2、HOXA10、HOXA11与犏牛雄性不育有关。

上述研究筛选出了牦牛、普通牛和犏牛睾丸组织的差异非编码RNA，并对其靶基因进行通路和基因富集分析，这些靶基因主要涉及DNA 复制过程损伤的检测及修复、细胞周期进程的调控、细胞黏附、迁移、免疫、代谢等信号通路，并具有核酸、蛋白质结合功能，表明这些非编码RNA 可调节精原干细胞分化、精子形成及精细胞凋亡等生物学过程。这些研究为更好地了解犏牛生精障碍的原因，揭示犏牛雄性不育机理提供了基础信息。

2 蛋白组比较研究

2.1 蛋白质组学主要研究方法

蛋白组学研究方法主要包括蛋白质分离、定量、鉴定。分离技术主要有双向凝胶电泳、双向荧光差异电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细吸管电泳、高效液相色谱和二维液相色谱等；定量技术主要有蛋白质非标记定量技术（Label Free）、相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）等，鉴定技术主要有肽质量指纹图谱等，酵母双杂交技术用于鉴定蛋白质与蛋白质之间的相互作用。定量蛋白质组是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。其中Label Free 用于分析不同组织或细胞之间的蛋白相对差异，i-TRAQ 利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N 末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较8 种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。目前，蛋白质组学研究方法已应用于牦牛犏牛比较科学研究中。

2.2 在牦牛犏牛科学研究上的应用

付伟等[12]等采集健康成年牦牛(n=4)、犏牛(n=2) 的睾丸组织，应用双向电泳-质谱技术对牦牛和犏牛的睾丸组织中差异蛋白质进行分离和鉴定，共获得差异蛋白19 个，其中表达量相当的蛋白2 个，与牦牛相比犏牛睾丸组织13 个差异蛋白低表达，4 个差异蛋白上调；发现T-复合蛋白、肽酰脯氨顺-反异构酶D、铁蛋白均有分子伴侣活性，且在犏牛睾丸组织中表达偏低，山梨醇脱氢酶是多元醇代谢通路的关键酶，该通路是精子获能的重要来源，在犏牛中低表达可能与雄性不育有关。

屈兵兵等[13]提取健康成年牦牛（n=9）、犏牛(n=7) 睾丸组织总蛋白，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，采用Westernblot 技术检测影响生殖活动的磷酸酶甲酯酶-1 (PPME1）在牦牛和犏牛睾丸组织中的相对表达水平，结果表明，PPME1 在犏牛睾丸组织中的表达水平显著低于牦牛，相差约14 倍，说明PPME1 在犏牛睾丸中的低表达可能与其雄性不育存在关联。

Yu 等[14]采集12 月龄的牦牛和犏牛（各3 头）的睾丸组织，应用iTRAQ 法对其蛋白组进行比较研究，共鉴定出显著差异表达蛋白256 个，与牦牛相比，犏牛睾丸组织88 个蛋白表达上调，168 蛋白表达个下调；排在前四位的上调蛋白分别是PTX3、S-100、H1.0 和Osteoglycin，排在前四位的下调蛋白是MHC class II、Ropporin-1、SNRPF protein 和Protamine 2，研究结果表明，大量上调蛋白可能参与应激反应、增强生精细胞间粘附性及抑制生精细胞从基底膜向生精小管管腔的迁移，许多下调蛋白与精子发生相关。

Sun 等[15]同样采用iTRAQ 方法对不同发育阶段的犏牛（10、12、14 月龄）睾丸蛋白组进行了差异分析，鉴定出12 月龄与10 月龄之间差异蛋白318 个，14 月龄与10 月龄之间差异蛋白327 个，两种对比下的差异蛋白GO 注释没有明显差异。

上述研究探究了牦牛、犏牛睾丸蛋白组表达差异，获得了一批表达差异明显的蛋白质，这些差异蛋白在细胞生长、细胞周期、精子发生等方面可能发挥重要作用，对不同发育阶段的犏牛睾丸蛋白组进行分析，证明了犏牛早期发育过程中睾丸生精能力就受到阻滞。

随着组学技术的发展，目前对犏牛雄性不育相关研究在睾丸转录组上已获得初步成果，探究了牦牛、普通牛、犏牛3 种牛睾丸组织转录组差异，找出了与精子发生、精原细胞分化及精细胞凋亡等相关基因及非编码RNA 的表达差异，为了更好地了解犏牛生精障碍的原因，为揭示犏牛雄性不育机理提供了基础信息。目前，蛋白质组学已经广泛应用于植物雄性不育等领域。但有关犏牛雄性不育的因果关系仍不清楚，尤其缺乏蛋白质水平的研究。因此，在现有科学研究进展基础上开展牦牛犏牛转录组蛋白组比较研究，有助于在理论上突破犏牛雄性不育生殖障碍。