circRNA与消化道肿瘤：进展和机遇

张明鑫路宁吴开春

作者单位：710077 西安 1西安医学院第一附属医院消化内科；710000 西安 2肿瘤生物学国家重点实验室，国家消化系统疾病医学研究中心，空军军医大学西京消化病医院消化内科

我国是消化道肿瘤高发国家，每年新发胃癌、食管癌和结肠癌超过100万例，约占全球消化道肿瘤新发病例总数的40%，给我国带来了巨大的医疗和经济负担［1-2］。由于多数消化道肿瘤患者确诊时已为晚期，总体预后较差，加上治疗过程中的放化疗耐药以及术后的复发和转移等因素，消化道肿瘤在所有癌症类型中死亡率较高。2018年全球癌症统计数据显示，胃癌和结直肠癌分别位居我国肿瘤发病率的第2位和第3位［2］。因此，临床上亟需可靠稳定的生物标志物进行诊断和预后预测，并进一步开发新的靶标来设计更高效的治疗方法。环状RNA（circRNA）由共价闭合环通过反向剪接形成，具有在真核细胞中含量丰富、高度稳定性、保守性和组织特异性等特点［3］。现有研究表明，circRNA可在各种水平（例如转录和转录后水平）参与肿瘤生物学行为［4］。本文就近年circRNA在消化道肿瘤中的研究作一述评。

1 circRNA简介

得益于高通量RNA测序（RNA-seq）技术的广泛应用，消化道肿瘤相关非编码RNA领域，尤其是lncRNA和miRNA相关研究迅猛发展并备受关注［5］。circRNA由前体mRNA（pre-mRNA）产生，然后被RNA聚合酶Ⅱ转录形成共价闭合的单链环状RNA分子，无5′帽子和 3′poly（A）尾巴［6］。circRNA 具有以下特殊特征：⑴丰富性，circRNA不仅广泛表达于人类各组织器官中，且其表达水平可达相应mRNA水平的10倍以上［7］；⑵稳定性，circRNA的共价闭环结构使其对核糖核酸酶（如RNase R）的消化具有抗性，并具有比线性RNA长达10倍的半衰期［8］；⑶保守性，无论物种之间的进化距离如何，circRNA都表现出高度的保守性［9］；⑷特异性，在不同细胞类型、组织或不同发育阶段，circRNA通常呈特异性表达［10］。既往认为circRNA是异常RNA剪接的无功能副产物，但随着研究的深入，尤其在2013年发现了一个经典的circRNA——ciRS-7（又称CDR1as），其可作为“miRNA海绵”，有超过70个miR-7结合位点，同时基于后续的一系列研究结果，circRNA迅速转变成为科学研究的重点和非编码RNA 领域的研究热点［11-12］。

2 circRNA参与消化道肿瘤进展的调控机制

2.1 circRNA参与消化道肿瘤放化疗抵抗

放化疗是肿瘤治疗的重要手段，对预防复发和转移具有重要意义。但是由于耐药性的产生，往往导致不良预后，肿瘤死亡率增加。circRNA可参与多种消化道肿瘤的放化疗抵抗。例如在抗紫杉醇的胃癌组织和细胞中均发现circPVT1过表达，敲低circPVT1可促进紫杉醇引起的细胞凋亡［13］。ZEB1是著名的紫杉醇抗性启动子，该研究还发现circPVT1通过“miRNA海绵”靶向miR-124-3p，促进ZEB1过表达后介导紫杉醇耐药。circFN1、circAKT3和circCCDC66也可通过“miRNA海绵”分别靶向 miR-182-5p、miR-198和miR-618，从而增强胃癌对顺铂的耐药性［14-16］。hsa_circ_0001546可通过激活ATM/Chk2/p53依赖性信号通路抑制奥沙利铂耐药［17］。沉默circRACGAP1表达可通过靶向miR-3657和ATG7抑制细胞自噬，从而增加胃癌对阿帕替尼的敏感性［18］。外泌体介导的ciRS122可通过miR-122/PKM2轴促进糖酵解，进而诱导结直肠癌奥沙利铂耐药［19］。hsa_circ_0079662可作为hsa_miR-324-5p“海绵”过表达靶基因HOXA9，然后通过TNF-α途径诱导结肠癌对奥沙利铂耐药［20］。在食管鳞癌中，circRNA_100367除了可抑制细胞增殖和迁移外，还可以通过miR-217/Wnt3途径降低肿瘤细胞的放疗抵抗［21］。circRNA_001275也被发现在耐顺铂的食管癌组织和细胞中表达上调，其过表达可增强顺铂耐药细胞增殖和侵袭，抑制凋亡，而circRNA_001275可能是通过miR-370-3p“海绵”上调Wnt7a的表达增强食管癌顺铂耐药［22］。hsa_circ_001680也能通过miR-340“海绵”上调BMI1表达，增强结直肠癌对伊立替康的耐药性［23］。由此可以看出，circRNA可参与多种消化道肿瘤的放化疗抵抗，且可能是通过“miRNA海绵”、代谢、自噬、外泌体等机制或方式实现。

2.2 circRNA参与肿瘤微环境

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是不同细胞类型之间相互影响的产物，在肿瘤的发生和发展、转移和治疗中起至关重要的作用［24］。最近研究表明，circRNA在调节胃肠道肿瘤的TME中起重要作用。第一，circRNA通过PD-L1调节免疫逃逸。circRNA可以作为ceRNA调节PD-L1的表达，从而帮助肿瘤逃避免疫监视。在结直肠癌细胞中高表达的has_circ_0020397可通过circ_0020397-miR-138途径上调PD-L1的表达，进而诱导T细胞凋亡、抑制T细胞活化和增殖，从而导致肿瘤免疫逃逸［25］。目前，针对PD-L1的药物已在结直肠癌等多种肿瘤中进行临床试验［26］。既往大量研究也已表明miRNAs在调节PD-1/PD-L1免疫检查点表达方面意义重大，再次印证了circRNA可通过circRNA-miRNA-PD-1/PD-L1途径促进免疫逃逸。第二，circRNA参与重塑细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。MMP家族可通过与基底膜上的大分子相互作用降解并刺激ECM重塑，从而有利于肿瘤细胞侵袭基底膜和基质，引起肿瘤转移。circRNA可通过调节MMP表达参与ECM重塑，在胃癌细胞中敲除circ_0000096后，VEGF和与迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达均显著降低，表明circ_0000096可能通过调节细胞外基质重塑和血管生成而影响细胞生长和迁移［27］。结直肠癌中高表达的 circLMNB1也可降低MMP-2和MMP-9表达，从而抑制上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），影响肿瘤扩散和侵袭［28］。第三，缺氧环境。缺氧是TME的关键特征，低氧的微环境可加强癌细胞对放疗的抗性，对肿瘤侵袭和治疗有重要影响［29］。有研究报道胃癌患者血浆中的ciRS-133可通过促进患者的白色脂肪褐变，加重肿瘤恶病质的同时增加耗氧，形成TME的缺氧环境［30］。综上认为，circRNA在TME中起多种作用，但有关研究仍处于起步阶段。

2.3 circRNA参与抗生长信号的不敏感

正常细胞中有多种抗增殖信号，通过阻止细胞周期而阻止细胞增殖，将细胞维持在静止状态。但是，癌细胞可以通过阻止肿瘤抑制因子表达或激活而逃避生长抑制，因此抗生长信号的不敏感是肿瘤细胞的十大特征之一。在多种肿瘤中，磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphase and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）可以促进G0-G1细胞周期及其他细胞功能活性；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21是一种细胞周期抑制蛋白，其过度表达可抑制细胞生长［31-32］。在胃癌中低表达的circ-ZFR可通过miR-130a/miR-107“海绵”参与PTEN调节［33］。CDR1as在胃癌组织中过表达，且与不良预后相关，此外CDR1as还可以通过miR-7“海绵”增强PTEN的表达，然后激活PTEN/PI3K/AKT通路，从而调节细胞增殖［34］。还有研究报道，circRNA-000425可作为miR-17/miR-106b“海绵”靶向p21，从而抑制胃癌细胞生长［35］。因此，未来可通过寻找参与逃避生长抑制的高效特异circRNA靶标，提高抗生长信号的敏感性，从而遏制消化道肿瘤生长。

2.4 外泌体相关circRNA

外泌体在介导细胞间通讯、TME、免疫系统功能、生长和分化、细胞信号转导和病毒复制等方面具有重要意义。circRNA在外泌体中表达丰富，且稳定性高。因此，外泌体相关circRNA在肿瘤诊断和治疗中的潜力逐渐凸显。外泌体circRNA主要是通过ceRAN机制竞争性结合miRNA，从而参与消化道肿瘤发生发展。例如，胃癌外泌体circSHKBP1可调控miR-582-3p/HUR/VEGF通路，抑制HSP90降解，促进胃癌增殖、侵袭、迁移和血管生成［36］。在有淋巴结转移的食管鳞癌中，血清外体circ_0026611表达显著上调，其诊断有无淋巴结转移的AUC为0.724（95%CI：0.604～0.865）；同时circ_0026611也是影响总生存期和无病生存期的重要因子，可作为预测食管鳞癌预后的指标［37］。还有研究发现，全身麻醉剂七氟醚可下调结肠癌外泌体 circHMGCS1水平，进一步通过外泌体介导的circHMGCS1/miR-34a-5p/SGPP1通路抑制结肠癌细胞存活和侵袭，并诱导细胞凋亡［38］。综上可见，外泌体circRNA以其高度特异性、保守性、稳定性等优点，有望成为预测消化道肿瘤诊断和预后的重要生物标志物和治疗靶标。

2.5 circRNA参与消化道肿瘤代谢

能量代谢改变是肿瘤的标志，旨在为肿瘤发生和发展提供必要的营养。已有研究显示circRNA可能参与消化道肿瘤糖酵解，例如外泌体介导的ciRS-122可通过miR-122/PKM2轴促进糖酵解，参与肿瘤耐药。目前研究推测，circRNA可能通过调节转录因子影响糖酵解：c-Myc可激活Warburg效应，也是重要的致癌转录因子之一，在膀胱癌中miR-145可通过沉默c-Myc抑制Warburg效应，而胃癌和结直肠癌中过表达的circRNA_001569可靶向抑制miR-145［39-41］。circRNA还可通过调节信号通路影响糖酵解，例如胃癌中高表达的circNRIP1可通过microRNA-149-5p-AKT1/mTOR途径参与胃癌糖代谢，提高胃癌细胞的葡萄糖摄取能力［42］。Wnt/β-catenin通路可通过上调 MCT1和 PDK1转录增强Warburg效应，而结直肠癌中circRNA_100290过表达，且可通过靶向miR-516b激活Wnt/β-catenin信号通路，也可能参与结直肠癌的糖代谢［43］。脂质产生增加是肿瘤代谢的另一标志事件，因为癌细胞的生长需要脂肪酸形成细胞膜。根据ceRNA网络分析和功能注释分析，在喉鳞状细胞癌中，hsa_circ_0033988表达水平较低，且与脂肪酸降解有关，但目前仍未在体外和体内实验验证［44］。综上可见，尽管与消化道肿瘤代谢相关的circRNA研究较少，但是现有研究已经初步证明circRNA参与代谢，未来需进一步研究和验证。

2.6 circRNA的翻译

作为非编码RNA，circRNA由于缺乏 5′帽子和 3′poly（A）尾结构，曾被认为无法翻译成多肽或蛋白质，但最近的研究有力地证明了circRNA可以编码蛋白质［45］。内部核糖体进入位点介导和m6A介导的翻译机制是两种主要的与帽无关的circRNA翻译机制［45］。circPPP1R12A 具有 216 nt开放阅读框，可编码73个氨基酸的肽段。研究显示circPPP1R12A在结肠癌中高表达，且circPPP1R12A翻译的蛋白质可通过激活结肠癌中的Hippo-YAP信号通路促进肿瘤细胞增殖和转移［46］。这一发现也为circRNA在消化道肿瘤领域研究提供了新的方向，进一步证明了circRNA的重要性。

2.7 circRNA与肿瘤转移

肿瘤转移往往会导致不良预后，其中EMT是导致肿瘤转移的常见机制。因此，目前circRNA相关EMT研究较多。例如，体内外实验研究表明，结肠癌中高表达的circPTK2可通过调节波形蛋白促进EMT［47］。circRNA还可通过一些常见通路调节肿瘤转移，例如，胃癌中过表达的circCCDC66与淋巴结转移相关，且circCCDC66除可促进EMT外，还可通过激活c-Myc和TGF-β信号通路促进胃癌转移［48］。此外，结直肠癌中缺氧诱导的circCCDC66过表达可通过miR-3140“海绵”促进自噬，进而促进肿瘤转移［49］。由于肿瘤的转移是多步骤、多阶段的，涉及肿瘤进展的多个方面，因此除自噬外，前述的肿瘤微环境、外泌体、代谢、翻译等均可参与circRNA调节消化道肿瘤转移。

2.8 circRNA的临床价值

已有大量研究表明，circRNA与消化道肿瘤患者总生存期、无病生存期、肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移、浸润深度和肿瘤大小等密切相关，并且手术前后的circRNA表达水平也有明显差异［50］。在诊断价值方面，胃癌血浆hsa_circ_0000520诊断的AUC为0.8967，灵敏度和特异度分别为82.35%和84.44%［51］。部分circRNA的灵敏度和特异度也优于传统的肿瘤标志物，如CEA和CA19-9等［52］。因此，具有表达特异性、保守性和稳定性的circRNA有望成为重要的消化道肿瘤早期诊断和预后判断的非侵入性生物标志物。

3 小结与展望

circRNA是一类新颖的RNA分子，具有独特的闭合连续环结构。本团队长期关注消化道肿瘤相关circRNA领域的研究进展［53］，发现circRNA在消化道肿瘤生物学进展中起着至关重要的作用。circRNA在消化道肿瘤中主要涉及放化疗抵抗、逃避生长抑制、代谢、TME等多方面，整体看来，circRNA主要是通过ceRAN机制或“miRNA海绵”、调节转录因子等调节肿瘤表型，也可能在外泌体的介导下进行。但是，大多数circRNA不能发挥“miRNA海绵”功能，因为大多数circRNA都包含较少的miRNA结合位点［54］。因此，circRNA参与消化道肿瘤“miRNA海绵”机制研究在未来可能逐步减少，而circRNA在翻译和与RNA结合蛋白相互作用等方向会逐渐增加。circRNA具有独特的结构和特性，在消化道肿瘤研究中潜力巨大，必然成为消化道肿瘤诊断、预后预测和靶向治疗研究的热点和重要的靶点。