受体相互作用蛋白1和受体相互作用蛋白3在细胞信号转导通路中的作用

魏敏，闫言，李莉，王宝玺

(中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院皮肤科，北京 100144)

免疫系统可通过激发各种机体保护反应(包括诱导炎症分子和干扰素)、激活细胞死亡途径，消除病原体感染或受损的细胞，从而应对感染和组织损伤。炎症及细胞死亡信号通路广泛存在于各类炎症疾病和退行性疾病中。受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)家族共有7个成员，即RIP1～7，其中RIP1和RIP3是调节炎症信号和细胞死亡途径的关键分子[1-2]。凋亡是一种可保持细胞膜完整性的细胞死亡形式，而坏死性凋亡是一种可导致细胞膜完整性受损的细胞死亡形式[3]。近年研究发现，细胞不同死亡途径间存在交互关联，不仅凋亡转导通路中的某些成分可以参与坏死性凋亡，有些成分还具有拮抗坏死性凋亡的作用[4]。因此，对细胞凋亡和坏死性凋亡的研究逐渐成为研究的焦点。细胞通过凋亡、坏死性凋亡或两种途径混合死亡，取决于导致细胞死亡的关键蛋白RIP1和RIP3。RIP1被上游信号激活泛素化修饰后，可激活核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)，使NF-κB解除IκB的抑制而移位入核，促进炎症因子的转录[5]。当受到胞内信号刺激发生去泛素化时，RIP1可通过与RIP3共有的RIP同型相互作用基序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)结合，激活下游胱天蛋白酶(caspase)-8、caspase-3，引发细胞凋亡[6]。若caspase的激活受到抑制，RIP1和RIP3则可激活混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain like protein，MLKL)，使其形成磷酸化的多聚体，破坏细胞膜，引发细胞坏死性凋亡[4,7]。现就RIP1和RIP3在细胞信号转导通路中的作用予以综述。

1 RIP1和RIP3的结构及功能

RIP家族共包括7个成员，即RIP1、RIP2、RIP3、RIP4、RIP5、RIP6和RIP7。RIP1由Stanger等[8]首先发现，被定义为含有死亡结构域的蛋白，因其可与死亡受体CD95的死亡结构域相互作用，故命名为“受体相互作用蛋白”。RIP家族成员均有一个同源的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域，具有激酶和非激酶的作用。当细胞周围刺激信号发生变化时(如病毒感染、发生炎症或组织损伤)，RIP蛋白家族被激发，可引发类瀑布样信号转导反应。

RIP1的分子质量为76 000，编码671个氨基酸，包含N端激酶结构域、C端死亡结构域和一个含有RHIM的桥接中间结构域[9]。RIP1可通过其死亡结构域以激酶非依赖性方式激活NF-κB或通过其RHIM发挥衔接子的功能，从而启动多个下游信号转导通路。RIP1的泛素化是其激活NF-κB所必需的，然而不同位置氨基酸的泛素化可导致不同的反应，如RIP1的第63位赖氨酸泛素化可激发NF-κB信号转导，而其第48位赖氨酸泛素化可导致RIP1降解，抑制NF-κB炎症反应[10]。热激蛋白90能够促进RIP1的调控，其功能受到抑制会影响RIP1功能的发挥及其应对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)刺激时下游信号的转导[11]。RIP1也可与其他含有RHIM的蛋白质相互作用，如RIP3、干扰素(interferon，IFN)-β、TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)以及DNA依赖的干扰素调节因子激活因子(DNA-dependent activator of interferon-regulatory factor，DAI)等[12]。RIP2除了含有激酶结构域、桥接中间结构域(不包含RHIM序列)，还包含C端半胱氨酸蛋白酶激活和招募结构域。RIP3的分子质量为56 800，由518个氨基酸组成，含有与RIP1相似的N端激酶结构域和RHIM基序[13]。RIP1和RIP3的激酶结构域可发生自身磷酸化，并可磷酸化MLKL[4,7]。RIP3的C端RHIM可介导RIP3与具有相同结构的RIPl、TRIF、IFN、DAI等蛋白的相互作用[14]。RIP3独特的C端片段可以与RIP1结合，抑制RIP1和TNF受体1(tumor necrosis factor 1，TNFR1)介导的NF-κB活化[15]。RIP4与RIP5均包括激酶结构域和桥接中间结构域，且均含有C端锚蛋白重复序列；RIP6和RIP7除了RIP家族共有的激酶结构域和锚蛋白重复序列，还包含一些其他结构域，如富含亮氨酸重复序列和WD40重复序列[4]。

2 RIP1和RIP3参与调控的主要信号转导通路

RIP1是一种多效性蛋白，可通过其死亡结构域以激酶非依赖性的方式激活NF-κB通路，还可通过其RHIM基序与其他含有RHIM的蛋白相互作用，包括RIP3、TRIF和DAI。其中，RIP1与RIP3结合可以作为一种真正的激酶同时触发细胞凋亡和坏死性凋亡。

2.1RIP1参与调控NF-κB通路 TNF、Fas配体及TNF相关的细胞凋亡诱导配体均可结合相应受体，激活RIP1，引发下游的炎症反应。例如，TNF与TNFR1结合形成信号复合物，导致磷酸化的RIP1结合E3泛素连接酶，同时诱发其他成员聚集而共同组成膜相关复合物，这些成员包括TNFR1相关死亡结构域蛋白、TNFR相关因子2和细胞凋亡抑制蛋白(celluar inhibitor of apoptosis protein，cIAP)等[16]。cIAP可通过其泛素连接酶在RIP1上形成赖氨酸63连接的聚泛素链和(或)线性泛素链组装复合体，激活NF-κB[17]。这种泛素化修饰排除了RIP3或Fas相关死亡结构域(Fas-associated protein with a novel death domain，FADD)与RIP1的结合，从而阻断凋亡的诱导。RIP1泛素化后可以被抑制性IκB激酶和转化生长因子-β激活激酶1的成员识别，导致抑制性IκB激酶激活，进而激活胞质中与NF-κB结合的IκB激酶，并促使IκB激酶进一步发生降解，导致NF-κB脱离与IκB的连接并移位至细胞核，与对应的DNA片段连接，导致下游的炎症因子在基因水平被转录；同时，NF-κB基本调节因子通过与RIP1的连接，抑制细胞死亡的发生[5]。NF-κB信号通路也可诱导抑制凋亡蛋白基因转录而负向调节凋亡，包括cIAP家族成员[18]、细胞 FADD样白细胞介素-1β转化酶抑制蛋白和抗凋亡Bcl-2家族等[19]。此外，RIP1还可通过隔离其他含有RHIM的蛋白质保护细胞免受RIP3介导的坏死性凋亡的侵袭[20-21]。

2.2RIP1和RIP3共同参与调控凋亡及坏死性凋亡通路

2.2.1凋亡通路及其调控 细胞凋亡于1972年由Kerr等[22]首次提出。细胞凋亡是机体调控发育、控制衰老、维系内环境稳态的重要机制。死亡的细胞可发生萎缩、膜起泡、染色质凝聚和DNA片段化，还可观察到膜结合的凋亡小体，而凋亡小体最终会被吞噬和消化。

细胞凋亡可以通过激活外源性途径中的细胞表面死亡受体或内源性途径中的线粒体、内质网效应器等多种信号可诱导细胞凋亡。外源性凋亡途径主要通过TNF、Fas配体及TNF相关细胞凋亡诱导配体与相应的细胞表面死亡受体结合，激活RIP1和(或)RIP3，引起下游的级联反应[23]。细胞表面死亡受体属于跨膜蛋白，为TNFR超家族。凋亡的内外源性途径间既互相关联，又互相独立，联合调控细胞凋亡。例如，根据细胞发生凋亡的途径不同，死亡受体Fas诱导的凋亡细胞可分为FasⅠ型细胞和FasⅡ型细胞，FasⅠ型细胞(如胸腺细胞)可直接通过caspase转导凋亡信号，而FasⅡ型细胞(如肝细胞)可诱导钙离子释放，从而促使使线粒体分裂，进而增强线粒体细胞色素酶释放,诱导细胞凋亡[24]。

启动外源性凋亡途径中TNFR1介导的凋亡，需要将膜相关复合物Ⅰ转变为胞质信号复合物，首先，Smac蛋白通过与cIAP结合，诱导cIAP上自毁的K43连接的泛素链，导致其降解[25]；然后，含有RIP1的膜相关复合物Ⅰ从质膜上解离，RIP1上的泛素链被去泛素酶去除；最后，膜相关复合物Ⅰ转换为由FADD、pro-caspase-8以及RIP1和RIP3组成的胞质信号复合物，胞质信号复合物通过caspase-8发出细胞凋亡信号，激活下游的caspase-3和caspase-7，启动外源性凋亡[6]。由于Smac蛋白是一种凋亡前释放到细胞质中的线粒体膜内间隙蛋白，因此推测，凋亡和坏死性凋亡在线粒体水平再次发生了改变。含有RIP1的细胞质复合物可以通过RIP1的死亡结构域募集FADD-caspase-8，并通过其RHIM域募集RIP3；而RIP3的激活对启动细胞凋亡非常重要，其中RIP3在227位丝氨酸(人)或231位苏氨酸、232位丝氨酸 (小鼠)磷酸化，RIP1在14位丝氨酸、15位丝氨酸、161位丝氨酸和166位丝氨酸磷酸化(人)[4]。激活后的RIP3和RIP1通过RHIM相互结合，并形成具有独特的形态学特征的促坏死复合体，而坏死复合体可激活其下游的坏死激酶[26]。He等[27]认为，可能是由于特定的突变或小分子与RIP3激酶位点的结合，或者只是由于RIP3过度表达，导致其招募RIP1，伴随着FADD参与的胞质信号复合物的激活。

2.2.2坏死性凋亡通路及其调控 RIP3是参与坏死性凋亡的重要分子，其导致坏死性凋亡的上游通路主要包括IFN、TNF、Toll和病原微生物RHIM，其中最主要的是TNF通路。TNF与TNFR1结合可形成膜相关复合物Ⅰ。当RIP1去泛素化后，胞质信号复合物形成，当caspase-8或FADD缺失时，RIP1与RIP3相互作用形成促坏死复合体[28]，发生坏死性凋亡。研究发现，某些病毒(如疱疹病毒)具有RHIM竞争功能，可通过抑制其自然宿主细胞中RIP3的激活对抗TNF诱导的坏死性凋亡[29-30]。IFN信号通路也是坏死性凋亡的主要机制，可直接通过RIP1和RIP3结合物激活MLKL引起坏死性凋亡；根据是否依赖于Toll/白细胞介素-1受体结构域，IFN信号通路分为依赖Toll/白细胞介素-1受体结构域和不依赖于Toll/白细胞介素-1受体结构域两种机制。Toll/白细胞介素-1受体结构域可诱导IFN-β激活RIP3，引起坏死性凋亡的发生；同时，IFN刺激可导致信号转导及转录激活因子1、信号转导及转录激活因子2和IFN调节因子9的持续表达，促进IFN诱发的巨噬细胞坏死性凋亡的发生[4]。除了被RIP1激活外，RIP3还可被其他细胞内含有RHIM的蛋白激活，包括TRIF[27]和DAI[31]。病毒双链RNA和脂多糖可分别激活病原识别受体Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)3和TLR4，进而激活下游的TRIF，TRIF可通过RHIM结构域被招募到RIP3上；坏死性凋亡发生的一个关键是caspase-8的活性被抑制，在caspase-8被抑制时，TLR3或TLR4激活可导致RIP3介导的坏死性凋亡[27]。抑制RIP1的活性可消除TLR4诱导的巨噬细胞坏死性凋亡[27,32]。然而，RIP1对于TLR3诱导的小鼠成纤维细胞坏死性凋亡是非必要的，表明除了RIP1外，RIP3还可直接被TRIF激活[32]。DAI参与激活先天免疫反应，病毒感染可激活DAI，DAI直接激活RIP3引起RIP1非依赖性坏死性凋亡[31]。因此，RIP3是一个可用于坏死性凋亡的信号整合分子，其可通过RHIM与其他含有RHIM的信号分子相互作用，导致接收坏死性凋亡诱导信号通路的差异。

MLKL是RIP3的下游靶标，激活的RIP3招募MLKL并在苏氨酸357位和色氨酸358位上磷酸化人MLKL，在丝氨酸345位和丝氨酸347位磷酸化小鼠MLKL[33]。MLKL磷酸化对坏死性凋亡的发生也非常重要。RIP3介导的MLKL磷酸化触发其构象变化，导致MLKL的N端四螺旋束暴露，进而导致MLKL寡聚，寡聚的MLKL可以结合磷脂(如心磷脂)，使MLKL与膜结合并将其N端插入各种细胞器和质膜，导致细胞坏死性膜破裂[34]。因此，RIP3的去磷酸化可抑制细胞坏死性凋亡的发生。

炎性肠病患儿炎症组织中的RIP3和MLKL水平均升高、caspase-8水平降低，这为研究坏死性凋亡和炎性肠病之间的联系提供了相关证据[35]。细胞膜破裂的确切机制目前尚不明确。Wang等[36]提出，MLKL可通过形成细胞膜孔道直接破坏膜的完整性，但目前仅体外脂质体研究支持该假设。此外，MLKL的磷酸化及其向膜的转运均不会引起自发性细胞死亡。Xia等[37]提出，MLKL可通过激活钙离子、钠离子或镁离子通道介导离子的流入，通过渗透压导致细胞死亡；在膜破裂前，MLKL的激活可导致质膜气泡形成，其特征是暴露出磷脂酰丝氨酸，而磷脂酰丝氨酸是一种具有吞噬作用的信号分子，与凋亡细胞死亡有关[38-40]。Gong等[38]和Yoon等[39]研究认为，ESCRT-Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ)蛋白组分是质膜气泡形成以及含有MLKL的外泌体脱落所必需的。

3 问题与展望

虽然近年关于RIP家族信号通路的研究取得了一定进展，但目前仍存在许多问题，如RIP1及RIP3参与调节的炎症等非细胞死亡与凋亡、坏死性凋亡之间复杂的相互作用以及坏死性凋亡的调控与执行，特别是MLKL破坏质膜及其在坏死性凋亡中对靶标细胞内膜的作用及调控机制。此外，RIP1和RIP3在炎性疾病和退行性疾病(如多发性硬化[41]、肌萎缩侧索硬化症[42]、阿尔茨海默病[43-44]、Niemann-Pick病[45]和遗传性视网膜变性[46])、癌症(急性髓系白血病、乳腺癌和结直肠癌[47-48]等)以及正常衰老[49]的发病机制中均具有重要作用，是许多疾病潜在的治疗靶标。目前一些常用的化学抑制剂，如RIP1激酶抑制剂Necrostatin-1[50]、caspase-8抑制剂z-VAD-FMK[27]、RIP3激酶抑制剂GSK-872(GSK2399872A)[51]、MLKL抑制剂坏死磺酰胺[7]以及热激蛋白90抑制剂阿螺旋霉素[52]等均可调控炎症、凋亡和坏死性凋亡。例如，在野生型雄性小鼠1岁后，使用RIP1活性抑制剂5个月可防止衰老的出现[49]。未来深入探究RIP1和RIP3作用的相关分子机制，可以为RIP1和RIP3参与调控的疾病(如衰老、癌症、炎性肠病)的诊疗提供指导。