HIV储存库形成及检测方法的研究现状

王雪，陈晓红

(哈尔滨医科大学附属第四医院感染科，哈尔滨 150001)

人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus，HIV)是一种双链RNA逆转录病毒，变异非常活跃。HIV-1主要选择性地侵入人体免疫系统的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，拷贝插入宿主细胞DNA中的HIV形成前病毒，即HIV储存库[1]。感染细胞以前病毒为模板，通过转录、剪切、翻译等借助宿主细胞内物质产生更多HIV颗粒[2]，创造新的感染周期，传播受感染的细胞，从而导致HIV的恶性传播。一般情况下，人体感染HIV后，如果不经抗病毒治疗，8～10年即可进展至艾滋病期，因此早发现、早治疗显得尤为重要。高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)的出现为获得性免疫缺陷综合征的治疗提供了新途径，但目前的治疗方法并不能彻底清除HIV储存库。因此，研发可清除宿主细胞DNA中携带整合、可复制的HIV储存库的策略迫在眉睫。HIV储存库对HAART和宿主免疫系统的清除具有抗药性，抗病毒治疗一旦停止，就会导致病毒反弹，引起新一轮的感染[3]。现就HIV储存库形成及检测方法的研究现状予以综述。

1 HIV储存库的形成

1.1HIV储存库潜伏期的机制 关于HIV储存库潜伏期的机制目前探讨最多的为整合前潜伏和整合后潜伏。整合前潜伏是指HIV以双链DNA的形式存在于静息CD4+T细胞胞质内，当外界抗原进入机体活化静息CD4+T细胞时，HIV就整合进入宿主遗传物质开始复制周期；整合后潜伏是指HIV的双链DNA先整合到宿主遗传物质中，以前病毒的形式维持病毒库的稳定[4]，其中整合后潜伏占主导要地位。

1.1.1表观遗传 表观遗传可调控细胞染色质，HIV DNA的整合位置主要是细胞染色质，因此HIV DNA的表达受相同表观遗传机制的调控。有研究证明，当DNA甲基化位于启动子时，可以导致体外潜伏期模型中的HIV原病毒表达沉默，这也是常见的与转录抑制相关的表观遗传机制[5]。因此，可通过DNA甲基化维持HIV潜伏期。Hughes等[6]研究发现，约70%的脊椎动物基因启动子与CpG岛的DNA元素相关，而CpG岛对DNA甲基化不敏感。CpG岛可以影响染色质调节因子的活性，这些调节因子可以翻译后修饰组蛋白并调节基因表达。另一方面，组蛋白乙酰化通常与活跃的转录相关[7]。用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A治疗HIV潜伏感染细胞，可以激活病毒，表明组蛋白去乙酰化在维持潜伏期中起主要作用[8]。

1.1.2位点选择 前病毒对于宿主DNA位点的选择存在特异性。对前病毒整合位点的进一步分析表明，HIV-1更倾向于主动转录的基因[9]。Singh等[9]对从培养的HEK293T细胞中分离的100万个HIV-1整合位点进行测序分析后发现，内含子和选择性剪接均有助于整合位点的选择。事实上，HIV-1整合酶通过与细胞剪接相互作用，在选择整合位点方面起关键作用。HIV-1整合酶可直接与晶状体上皮源性生长因子/p75相互作用，通过将整合前复合体与染色质结合促进HIV整合[10]。晶状体上皮源性生长因子/p75常与许多剪接因子相互作用，并通过这些剪接因子将HIV-1整合到高度剪接的转录单元上。由此可见，HIV-1通过选择主动转录的基因进行整合来避免潜伏期。

1.1.3转录干扰 整合是HIV复制中关键且不可逆的环节，尽管有抑制性抗反转录病毒治疗，但HIV在长寿命细胞库中仍持久存在，即潜在的前病毒常在高表达基因中整合，表明高表达基因的转录可干扰病毒的转录[11]。Lenasi等[12]研究证明，宿主基因在转录时会抑制整合在基因中的前病毒的表达。当前病毒DNA的极性与宿主基因的极性相同时，启动子就会被阻断，在这种情况下，通过延长RNA聚合酶Ⅱ的转录可干扰HIV-1转录所必需的转录因子的组装，而转录起始复合物的缺乏会导致HIV-1潜伏期[13]。因此，在病毒潜伏期，HIV-1可以通过抑制上游转录或协同激活病毒转录起始和延伸来抵消转录；然而，当前病毒DNA与宿主基因具有相反的极性时，RNA聚合酶Ⅱ可能发生碰撞，导致病毒转录提前终止[14]。

1.1.4病毒蛋白与HIV-1再激活 HIV感染细胞的潜伏期受两种HIV-1蛋白(即Tat和Vpr)的调节。Tat是转录的反式激活因子，也是编码于HIV基因组中的一种关键调节蛋白，受单个HIV启动子控制。Cao等[15]通过研究HIV感染细胞的潜伏机制和反式激活细胞表型发现，增加Tat乙酰化可显著增加Tat和病毒的产生，而增加Tat反式激活可更快地反式激活潜伏细胞。作为病毒反式激活因子的调节蛋白，Tat的缺失是HIV-1潜伏期的一个关键因素[16]。而HIV-1辅助蛋白Vpr则可再一次激活潜伏感染的细胞。对HIV-1感染患者进行血清学检查发现，患者外周血中Vpr的数量显著高于Tat，因此细胞外Vpr在激活HIV-1潜伏感染细胞中占据重要地位[17]。Rev也是一种调节蛋白，可结合HIV的信使RNA，促进病毒中信使MRA的核质转运，且需要多个Rev单体结合Rev反应元件将病毒信使RNA转运至细胞质，因此Rev表达水平与功能间的关系是非线性的[18]；同时，还需要一定水平的Rev维持病毒蛋白的活性表达，Rev表达不足则可能导致HIV-1潜伏期[19]。

1.2HIV储存库的存在部位 HIV DNA储存库存在于外周血的多种细胞中，主要包括单核细胞和中心记忆CD4+T细胞、过渡状态的记忆CD4+T细胞以及效应记忆CD4+T细胞等。

1.2.1淋巴结 淋巴结是主要的HIV储存库,高水平激活和高水平复制的特点可以快速诱发其感染新的细胞。因此，淋巴结在HIV储存库的动态变化中起重要作用。Fukazawa等[20]通过研究恒河猴胚胎干细胞模型发现，滤泡辅助性CD4+T细胞多在分化过程中被感染，且不易被特异性免疫反应或抗反转录病毒药物所获取。可见，淋巴结是HIV储存库清除的一个障碍。Lorenzo-Redondo等[21]研究证实，在HIV感染者行HAART过程中，淋巴组织中的HIV发生了变化，表明HIV储存库存在进行性复制。但当HAART中断时，会出现许多表达不同病毒RNA的变异细胞，有助于HIV的反弹[22]。

1.2.2内脏相关淋巴组织 对人类和猿类模型的研究显示，内脏相关淋巴组织包含人体60%的淋巴细胞，内脏相关淋巴组织通过辅助性T细胞17耗竭、细菌易位和局部宿主细胞激活等方式促进HIV复制，导致HIV在细胞感染中持续存在[23-25]。在急性和早期HIV感染期间，胃肠道CD4+T细胞的HIV DNA载量较血液中CD4+T细胞的HIV DNA载量平均高13倍[26]。非CD4+T细胞在肠道中携带的HIV DNA较CD4+T细胞携带的HIV DNA少，但内脏相关淋巴组织中非CD4+T细胞的感染水平高于血液[27]。在内脏相关淋巴组织中，髓细胞也含有HIV DNA[28]。在HAART启动后，内脏相关淋巴组织中的HIV DNA载量降低但不会消失[29]，且HIV DNA载量在不同的肠道位置存在差异[30]。在回肠和直肠细胞中，记忆效应CD4+T细胞中含有的HIV DNA最多[31]。与未接受HAART的患者相比，接受HAART患者直肠中的HIV DNA载量升高[32]。可见，内脏相关淋巴组织中的总HIV DNA与感染不同阶段血液中的总HIV DNA载量相关。

1.2.3其他组织 中枢神经系统在单核细胞将感染由外周转移至大脑的过程中具有特殊作用[33]。单核细胞可迁移到各种组织并分化为抗原呈递细胞，如巨噬细胞、胶质细胞和树突状细胞等。胶质细胞是大脑中HIV-1的主要靶点，在中枢神经系统中可以作为HIV储存库发挥作用[34]。另外，由于血脑屏障的存在，大部分抗病毒药物难以透过血脑屏障进入大脑，因此血脑屏障也成为HIV的天然保护层，增加了病毒耐药突变的发生率[35]；其次，脑内潜伏的HIV较少与外周细胞或组织进行遗传物质交换[36]。由于HAART仅可起到局部抑制作用，且目前的抗病毒药物对脑内的病毒无效，因此含有HIV DNA的细胞一直存在[37]。另外，脂肪组织中的记忆CD4+T淋巴细胞也是一个潜在、重要的HIV储存库，在未经治疗的猕猴和接受有效治疗的HIV感染者中均检测到HIV DNA[38]。未来，测量不同组织和液体中的总HIV DNA，有助于评估针对清除HIV储存库的治疗策略。

1.3HIV DNA在病毒复制中的主要存在形式 在HIV储存库中，非整合的前病毒占比为10∶1～100∶1，主要包括线性非整合DNA和环状非整合DNA[39]。其中，环状非整合DNA包括1个长末端重复序列 (long terminal repeat，LTR)和含有2个LTR的环状HIV DNA。线性非整合DNA和环状非整合DNA在分子结构、稳定性、表达特性以及在潜伏期中的作用等方面均存在差异。线性非整合DNA结构不稳定，很容易降解，因此其临床意义较小[40-41]；2-LTR HIV DNA的结构较特殊，因此与线性非整合HIV DNA相比，2-LTR HIV DNA的临床意义更大[42]。非整合形式前病毒主要存在于感染细胞内，参与HIV致病机制的形成。而整合的前病毒大部分因高突变、缺失以及转录后沉默造成缺陷不能形成病毒复制，这些缺陷前病毒的作用可能与非整合前病毒作用一致。在HIV持续复制中真正起作用的前病毒所占比例较小，非缺陷的整合前病毒是最稳定的形式[43]，可导致潜伏性感染或有转录活性的感染；同时非缺陷的整合前病毒也是HIV储存库的基本成分，是病毒清除的主要障碍[44]。

2 HIV DNA的检测方法及意义

2.1HIV DNA的检测方法 HIV储存库的检测方法主要包括以细胞培养为前提的病毒外生测定法以及基于DNA储存库核酸结构的定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测法。而关于DNA储存库的临床研究主要应用荧光定量PCR检测法。

2.1.1Alu-gag PCR Alu-gag PCR是检测感染细胞中整合前病毒的一种定量分析方法[45]。该方法主要通过两个步骤实时PCR检测：①用与Alu、gag序列匹配的引物扩增gag与最近的Alu之间的区域[46]；②通过巢式PCR扩增识别第一步骤中特异性扩增产物中长末端重复序列的R-U5区域[45]。Alu-gag PCR检测精确且灵敏度高，对整合前病毒的量化十分灵敏。Alu-gag PCR检测的弊端在于不能辨别缺陷病毒与非缺陷病毒，导致实际测出的HIV储存库远高于理论数值。

2.1.2定量病毒生长检测法(quantitative viral outgrowth assay，Q-VOA) Q-VOA可以检测出有复制能力的前病毒的数量[45]。传统的Q-VOA以健康供者的CD4+T淋巴细胞为目标，其病毒复制率低，且耗时长、成本高、程序复杂；最新的Q-VOA则以CC趋化因子受体5和CXC趋化因子受体4共受体的人急性淋巴母细胞白血病细胞/CC趋化因子受体5体外细胞株为目标，其克服了病毒复制率低、耗时长、成本高等缺点[45,47]，因此目前广泛应用于临床。但最新的Q-VOA也存在弊端：①其仅能检测HIV生命周期的一个组成部分，无法完整检测组织中的病毒库，导致实际测出的HIV储存库远高于理论数值；②检测的血样本量较小，准确检测的血样本量应>150 mL[45]；③检测耗时长且成本高，患者难以接受。

2.1.3Tat/Rev诱导的限制稀释法 Tat/Rev诱导的限制稀释法是一种基于PCR的分析方法，可重复、敏感地测量临床样本中有效和潜在的感染HIV的CD4+T细胞的频率[48]。这些有效和潜在的感染HIV的CD4+T细胞主动产生编码Tat/Rev蛋白的多重剪接RNA，因为多重剪接RNA在潜在感染细胞中不存在，但在病毒重新激活后可被诱导[48]。虽然Tat/Rev诱导的限制稀释法需要较小的血样量，不需要提取病毒核酸，但仍会导致实际测出的HIV储存库数量远高于理论数值[45]。

2.2HIV DNA定量检测的意义

2.2.1在早期筛查方面的意义 HIV DNA作为HIV储存库标志物，其最主要的优势为窗口期最短，即在感染HIV后3～7 d就可建立HIV储存库，因此将其应用于HIV早期筛查可准确揭示病毒感染程度、患者病情进展及临床分期。在国内，HIV DNA定量检测技术还具有价格相对较低且稳定性高等优势，同时需要的血液量少、所受干扰少、特异性高，因此可用于婴幼儿HIV感染的诊断。HIV DNA可以在血液和其他体液中被检测到，HIV DNA定量检测技术是组织活检标本中应用最广泛的量化HIV储存库的方法[49]。在大多数情况下，血清学检测在区分 18个月以下婴儿HIV抗体来源方面缺乏足够的敏感性和特异性，因此HIV DNA检测有助于确认特异性抗体产生不足时的HIV感染[50]。采集婴儿血样标本时应注意：①要具备小婴儿静脉穿刺所需的专业知识；②在2～25 ℃下运输和储存血样标本；③在获得血样后4 d内进行检测。

2.2.2在病情预测方面的意义 HIV DNA定量检测具有简单、标准化、灵敏和可重复的特点。在临床上，HIV DNA载量可以反映HIV感染的过程，特别是，HIV DNA是获得性免疫缺陷综合征进展和死亡的预测因子，独立于HIV RNA和CD4+T细胞计数之外。基线总HIV DNA载量可预测HAART，HIV DNA载量在HAART期间降低但仍可量化，其水平既可反映感染史(HIV RNA峰值、CD4+T细胞计数的最低点)，也可反映疗效(残余病毒血症、累积病毒血症、免疫恢复、免疫细胞活化)[51]。血液中总的HIV DNA载量还可预测某些HIV-1相关终末器官疾病的存在和严重程度。虽然HIV DNA不能区分复制能力强的和有缺陷的潜伏病毒，但血液、组织和细胞中的总HIV DNA载量可从某种程度上反映HIV的发病机制，这可能由于所有的病毒形式均参与了宿主细胞的激活和HIV的发病过程。HIV DNA是获得性免疫缺陷综合征进展和死亡的预测因子，HIV DNA载量高的患者病程进展快、免疫功能差、并发症严重且合并感染及病死率均更高[51]。

3 小 结

虽然经HAART后HIV感染者的寿命延长，但长期服药的依从性不良、耐药性、不能彻底根除HIV仍是HIV感染者潜在的致命威胁。彻底治愈HIV感染者，HIV储存库仍是研究重点。首先应明确HIV潜伏感染的机制，找到准确且敏感的测量方法以量化HIV储存库的大小。虽然研究者尝试多种方法清除体内整合的HIV，且取得了一定进展，但要应用于临床还需更深入的研究。HIV DNA作为HIV储存库的标志物具有临床相关性，可在临床实践中广泛应用。将HIV DNA用于监测HAART的效果，或许可为减少或清除HIV策略的研究提供新思路。