子宫内膜异位症动物模型建立方法

陈元欢，武权生，周小静，蔡爽，乔新颖

(甘肃中医药大学，兰州 730000)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)指子宫腔内具有活性的内膜组织出现在子宫腔以外的部位，发病率高达10%～15%，复发率高，并有逐渐增加的趋势，且存在一定的恶变率，多见于育龄期女性[1-2]。EMT异位病灶的形态及组织特点随月经周期的变化而变化，因此EMT的主要临床表现为周期性的下腹部坠胀疼痛，且进行性加重，偶尔伴有肛门下坠感、性交痛及月经紊乱，严重者可导致不孕，影响患者的生活质量及生理、心理健康。目前，临床多采用激素类药物治疗EMT，治疗周期长且副作用大，如达那唑可导致痤疮、体重增加和毛发增多等；促性腺激素释放激素类药物可引发低雌激素症状(如潮热、阴道干燥和性欲减退)，较难根治。因此，明确EMT的病因、病机是研究的主要目标，对指导临床治疗有重要意义，而构建EMT动物模型是相关研究的基础。

Jacoson于1922年首次用兔子成功建立了EMT动物模型[3]，但由于兔没有规律的动情期，故此项研究对临床的指导意义存在争议；随着相关研究的不断探索发现，大鼠与人类基因谱较接近[4]，故可将大鼠作为主要的实验类研究对象。1998年Vernon和Wilson借助自体移植法成功建立了EMT大鼠模型[5]，此后国内外学者不断探索丰富了各种建模方法，包括自发性、诱发性以及种植性等方法。现就EMT动物模型建立方法进行综述，以期明确各种不同造模方法的潜力与局限，为造模方法的合理选择提供参考。

1 自发性动物模型

1.1灵长类自发性动物模型 MacKenzie和Casey[6]在尸检猕猴时发现，猕猴盆腔内存在充满灰色或巧克力色液体的囊肿，之后D′Hooghe等[7]使用腹腔镜首次发现怀孕期间的狒狒可自发EMT，且随后的研究发现，约27%的狒狒患有EMT[8]。Eva Gruber-Dujardin等[9]借助自发性恒河猴EMT动物模型，对其异位子宫内膜病灶的解剖分布、大体形态、组织学分化、免疫组织化学等进行详细的研究发现，非人灵长类动物发生EMT的发病部位及病理学组织结构特征与人类相近。国外研究报道，非人灵长类动物的EMT发病率高于人类[10-11]。EMT的发病机制尚不明确，其相关假说包括经血逆流学说、在位内膜决定论等，其中经血逆流学说在EMT的发病中具有至关重要的作用，月经和EMT仅自然发生于部分女性和非人灵长类动物中，使构建非人灵长类动物模型成为研究EMT病因、发病机制及治疗方法的主要手段，但EMT动物模型的成模率低，研究周期长，需要极大的人力、物力，且定期检查对动物造成一定的创伤，可能影响实验结果，因此该造模方法较难应用于实验研究中。

1.2K-ras基因激活小鼠模型 K-ras是一类原癌基因，可通过点突变的方式激活，EMT的恶变与K-ras基因的激活有一定相关性[12]。研究发现，K-ras 4B基因在EMT患者在位内膜中表达增加，K-ras 4A于增殖期在EMT患者在位内膜组织中表达，高于非EMT患者[13]。Dinulescu等[14]将表达Cre重组酶的重组腺病毒载体注射到loxP-Stop-loxP-K-rasG12D/+(LSL-K-rasG12D/+)小鼠卵巢囊中，以激活致癌K-ras基因，注射8个月后，除卵巢发生子宫内膜样变外，47%的小鼠同时发生了腹膜EMT，病变子宫内膜异位腺内的上皮细胞被Cre介导发生K-ras激活，病灶发生的潜伏期较长、发生率低。因此，该动物模型的EMT虽为自发性，但目前并无K-ras基因突变导致EMT发病的报道，故该模型的研究对EMT病因及发病机制的研究无指导意义，仅可用于对EMT形态学的观察及新治疗方法的研究。

2 诱发性动物模型

2.1单纯重复妇科手术操作 Sampson提出了EMT病因的种植学说[15]，指出具有活性的子宫内膜组织可经输卵管逆流至其他部位，并因引力作用种植于该部位，当手术治疗时，可能导致子宫内膜腹腔或盆腔种植，亦可造成EMT。Harirchian等[16]通过对实验动物重复进行诊断性刮宫及腹腔镜操作，构建了EMT狒狒模型，内膜种植1个月后即可在腹腔镜下观察到EMT病灶，且手术切除术后的EMT复发率为75%。上述EMT动物模型与人类EMT的病因及发病机制部分相似，但发病周期较自发性动物模型短、成模率较高，且通过腹腔镜观察成模情况，对动物创伤较小，是较理想的造模方法，但该方法对实验动物的要求较高，所需实验动物需有规律月经周期，但满足条件的实验动物有限，饲养要求高，导致实验成本升高。

2.2经血逆流法 朗景和[17]在子宫内膜种植学说基础上进一步补充说明，提出了“在位内膜决定论”，阐述了在位内膜的分子生物学特点，即异位内膜通过黏附、侵袭和血管形成，最终发展为异位病灶，这是EMT发生的决定因素。以“子宫内膜种植学说”和“在位内膜决定论”为理论指导复制EMT动物模型，根据实验动物有无规律阴道出血，造模方法分为宫颈环扎术和子宫内膜逆流法。

2.2.1闭锁宫颈口 闭锁宫颈口可用于有规律月经的一类实验动物，D′Hooghe等[18]借助硅胶、电凝及结扎等方法闭锁宫颈口，构建EMT狒狒模型；李舒婷等[19]借助宫颈环扎术成功构建EMT食蟹猴模型，通过慕丝林宫颈环扎带的穿刺针穿过子宫的无血管区完成宫颈环扎术，使食蟹猴的月经血不能从阴道流出，而经输卵管流至腹腔，符合经血逆流学说，并通过观察舌面舌底血液灌注量探讨舌象变换与证型的相关性。非人灵长类动物生殖生理特性与人相似，上述方法通过堵塞宫颈促进经血逆流建立模型，对临床具有指导意义；但该造模方法的EMT发病原因局限，仅适用于研究EMT的发病机制、组织形态及治疗，且所选实验动物需有规律的内膜剥脱出血现象，目前用于EMT研究的动物中仅有非人灵长类动物具有这一特征，而非人灵长类动物多为保护级动物，数量有限且饲养要求高，因此此类造模方法并不能推广。

2.2.2子宫内膜逆流法 子宫内膜逆流法可用于无规律子宫出血动物的EMT模型建立，如兔、大鼠、小鼠，王哲和路芳[20]通过此法成功构建EMT Wistar大鼠模型，于子宫近输卵管端作纵向切口，随后反复搔刮子宫切口并使用0.9%氯化钠溶液向盆腔冲洗内膜组织，模拟人因反复宫腔操作导致EMT发病的过程，成模率70%。子宫内膜逆流法操作简单，同时啮齿类动物来源广泛、饲养简单、实验成本低、复制方便，与通过手术移植构建EMT模型的方法相比，减少了因手术因素导致的差异；但是，子宫内膜逆流法的成模率较手术移植方法低，实验周期较手术移植构建EMT模型长，且反复手术操作对实验动物的创伤较大，存在动物不能耐受以及感染发生风险高的不足[20]。

2.3药物诱导法 Eskenazi等[21]的研究发现，EMT的发病率与环境中二英浓度呈正相关。Rier等[22]的研究发现，二英的慢性暴露与猕猴EMT的发生率有关，认为EMT模型也可通过药物诱导获得。张静怡[23]通过米索前列醇成功诱导了恒河猴的子宫腺肌症，即将一定量米索前列醇与0.9%氯化钠溶液混合，连续6个月同一时间经阴道注入阴道后穹窿处，并保证无药物从阴道流出。药物诱导法可避免手术操作中炎症因素对实验结果的影响，可针对性地研究EMT的病因及发病机制；但通过药物诱导建立EMT动物模型的研究较少，由于实验过程中可能出现的问题及风险无法预料，且无明显原因发生EMT的患者较多，此法EMT模型可能影响实验动物的内分泌及免疫系统，故对EMT患者的临床指导意义较小；同时，建模周期长，且需开腹探查明确异位内膜组织的形成，以上均限制了其应用。

2.4手术移植法

2.4.1自体移植法 Vernon和Wilson[5]首次通过自体移植法成功建立EMT大鼠模型，随后该方法被不断完善，成为构建EMT动物模型的常用方法。自体移植法包括子宫组织块移植和子宫内膜移植，与子宫组织块移植相比，子宫内膜移植较少发生粘连[24]，因此，近年来多将子宫碎片的肌层与内膜分离，将分离的子宫内膜组织通过不同方法置于腹腔内不同部位或皮下：①腹腔内移植法[25-30]：利用可吸收缝线将分离的内膜组织缝合于腹腔内不同部位，如腹壁、肠系膜、肠壁等部位；②腹腔内注射法[31-32]：将剥离好的内膜组织剪成0.5 mm×0.5 mm的碎片，经左下腹注入腹腔；③皮下移植法[33-34]：将分离好的子宫内膜组织置入腹肌与皮下筋膜层之间；④皮下注射法[35-36]：用注射器将含有子宫内膜碎片的0.9%氯化钠溶液注射至尽量远离腹壁切口处的皮下。上述方法中使用的子宫内膜组织均取自实验大鼠自身的子宫，不存在免疫排斥反应，可观察EMT的免疫发病机制及药物治疗作用。

与腹腔内注射法、皮下移植法及皮下注射法相比，腹腔内移植法使用较多，技术更成熟，且定位准确、成模率高，腹壁、骶韧带等EMT好发部位均可移植成功，但将内膜与欲移植部位缝合可能引发炎症，造成盆腔粘连，病灶周围病理形态改变，影响对病灶的观察和测量，从而影响实验结果。而腹腔内注射法与皮下注射法避免了这一缺点，更符合子宫内膜的自然黏附原则，同时可更直观地观察病灶发生发展的过程；但腹腔注射法易增加脏器浸润的机会，皮下注射法因组织块较小、生长缓慢，故两法成模率均不高，且注射的含有内膜的0.9%氯化钠溶液浓度较难统一，易存在误差。皮下移植法与皮下注射法均符合种植学说，与女性EMT的发病更为接近，且操作简单，避免了内膜缝合，但移植后实验动物需腹腔注射雌激素，以促进内膜黏附，若实验目的与激素有关，此法不适用。

2.4.2同种异体移植法 同种异体移植法是指将同系实验动物的内膜组织进行异体移植。张薇等[37]发现，同种异体Wistar大鼠EMT模型的成模率略高于自体移植成模率。崔金秀[38]通过皮下移植法成功构建大鼠同种异体EMT模型，成模率为66.7%。崔阳阳等[39]通过“腹腔+皮下”注射法成功构建EMT KM大鼠模型，除内膜组织来源不同外，其余方法均与自体移植法相同，不仅避免了对实验动物子宫完整性的破坏，且避免了腹腔手术操作，减少了手术及异物对盆腔微环境的影响，故该方法简单易重复，对受体小鼠的创伤小，降低了因感染或反复手术操作导致的死亡率。但同种异体移植法在EMT动物模型构建中的使用较少，实验动物对同种属来源的异位子宫内膜免疫排斥的程度以及是否影响成模率尚不清楚。

2.5宫腔开放法 哈春芳等[40]通过宫腔开方法成功构建了EMT Wistar大鼠模型，即将实验大鼠子宫内膜面缝合至子宫骶韧带及大网膜血运丰富处，成模率(81.08%)与传统方法成模率(83.78%)差异较小，且肉眼所见病灶多以粘连为主，局部可见炎症细胞浸润。宫腔开放法充分利用炎症诱导的腹腔内环境建立EMT模型，与EMT雌激素依赖性炎症性疾病的特征较为相似，且内膜组织与盆腔的接触面较大，便于取材、观察；与传统移植法相比，宫腔开放法不需要制备移植物，操作简单，成模率与自体移植法无明显差异，是较理想的EMT方法。但该方法使用较少，且相关实验研究少，对实验结果的不良影响亦不明确。

3 种植法动物模型

种植法又称异种异体移植法[41]，即将人的异位内膜组织种植于实验动物体内，主要移植方法包括①增殖期/分泌期内膜移植；②人在位内膜/异位内膜/蜕膜组织等不同来源移植物移植，Stocks 等[42]手术切除裸鼠卵巢，皮下植入缓释雌二醇胶囊，将人子宫内膜组织片段注入裸鼠腹腔，成功建立人源性裸鼠EMT模型；③纯化不同子宫内膜细胞种植；④人免疫功能重建EMT模型。

与其他方法相比，异种异体移植法保留了人异位内膜的组织形态及生物特性，使病灶的病理改变与人体更为接近，且对药物的反应无变化，因此对研究 EMT的发病机制及治疗具有重要意义；但此法仍存在不足：①对实验动物的要求较高，目前仅免疫缺陷小鼠符合要求，对手术耐受性较小，多次手术操作易造成小鼠死亡；②由于实验小鼠存在免疫缺陷，故不能用于免疫因素与EMT关系的研究；③移植物存活时间短，后续研究的开展时间受限；④免疫缺陷小鼠存在免疫功能缺陷，影响腹腔液中的细胞因子，不能应用于EMT免疫学机制的研究；⑤将人的内膜组织用于实验研究不符合伦理要求，限制了此方法的推广。

4 小 结

成功构建EMT动物模型是EMT研究的关键环节，而成功的EMT动物模型不仅需要完全复制EMT的病理特征，还应考虑EMT的发病原因与机制。同时，应考虑动物实验研究的可行性及成本、周期及成功率。因此，应根据研究目的、实验室条件、经济能力等，结合不同动物模型的优缺点综合考虑，选择合适的模型，对EMT的病因及发病机制进行探讨，并发现EMT低复发率及较少不良反应的治疗手段。自体移植法、经血逆流法及药物诱导法均需使用狒狒等保护动物进行实验，故较难推广；种植性动物模型需要人异位内膜组织，违反了伦理要求，也不能用于实验研究；各种手术移植法存在不同的缺陷，但使用广泛，且在不断完善，是未来建立EMT动物模型的主要方法。