PCR技术在新冠病毒核酸检测中的应用

张礼堃，邹秉杰综述，宋沁馨，周国华综述

0 引 言

新型冠状病毒 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一种单链正股RNA病毒，属于冠状病毒科，β病毒属(Betacoronavirus)[1]。SARS-CoV-2可以发生人际传播，且传播能力强于2003年出现的SARS-CoV[2]。其主要传播方式主要为接触传播和飞沫传播[3-4]。人体感染新型冠状病毒后，轻症患者会出现以发热、干咳为主的症状，重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，甚至发展为急性呼吸窘迫综合征及多器官功能衰竭等[5]。由于SARS-CoV-2的强传染性和致死性，使用快速、准确、便利的诊断方法对其进行检测是发现传染源、阻断疾病传播链进而防控疫情的关键。

常用的病原体检测方法有病原体培养、血清抗体检测、核酸检测等，其中病毒培养检测耗时数天，效率过低；血清抗体检测特异性较低[6]。因此临床上最普遍的检测手段是时间更短、特异性更强、灵敏度更高的核酸检测方法。目前已有多种SARS-CoV-2的核酸检测方法，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、环介导的等温扩增、CRISPR/Cas系统等[7-10]。其中PCR技术是最早发展起来的核酸扩增技术，通过高温变性、低温退火、引物延伸的多次循环可将靶标扩增上万甚至上亿倍。作为一种相对成熟的核酸扩增技术，PCR技术目前已被广泛应用于生命科学的多个领域[11-13]。

本综述对目前基于PCR原理检测SARS-CoV-2的方法进行了总结和展望。

1 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, rt-qPCR)

实时荧光定量PCR属于第二代PCR技术，可以对核酸进行定量检测。该方法利用核酸扩增时产生的扩增曲线来对其初始浓度进行定量计算，目前主要的方法包括荧光染料法和TaqMan探针法。

1.1rt-qPCR检测SARS-CoV-2的原理荧光染料法的原理是：在反应体系中加入一种可以与双链核酸非特异性结合的荧光染料，每一轮循环结束时染料就会结合在扩增产生的双链核酸上，并产生荧光。根据荧光信号达到预定荧光阈值时所经过的扩增循环数(Ct值)就可判断目标核酸分子的有无。

TaqMan探针法的原理是：在反应体系中加入一种可以与靶标特异性结合的寡核苷酸探针，其两端分别连接荧光基团和淬灭基团，二者共存时由于荧光能量共振转移现象，无荧光产生。在引物延伸的过程中，具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶会将探针5’端的荧光基团切割下来，从而产生荧光。根据扩增循环数(Ct值)，可判断靶标分子的有无。

SARS-CoV-2的遗传物质是单链RNA，其核酸检测过程包括逆转录和PCR扩增两个步骤。首先在逆转录酶的作用下，病毒RNA被逆转录为cDNA，然后DNA聚合酶再对cDNA进行扩增。根据样本扩增曲线的Ct值，即可判断样本中是否含有SARS-CoV-2核酸。我国国家卫建委推荐的标准是：Ct值<37，可报告为阳性；无Ct值或Ct≥40，为阴性；Ct值在37～40，则重复实验。

1.2rt-qPCR在新冠检测中的应用rt-qPCR是WHO、中国国家卫生健康委员会等单位推荐的新冠肺炎确诊的标准之一。但是，从大规模的检测结果来看，rt-qPCR具有“假阴性”问题，其阳性检出率仅为30%。“假阴性”的一个重要原因是待测样本中病毒载量低于常规rt-qPCR检测限，因此，提高rt-qPCR的灵敏度非常关键。

选择新的扩增位点，并设计新的引物可以提高rt-qPCR的检出率。目前常见的目标序列包括非结构基因orf1a、nsp-12(RdRp)、nsp-13(Helicase)、orf1b等，以及结构基因E gene、S gene、N gene等[14]。SARS-CoV-2PCR的检测靶标通常包含一个非结构基因和一个结构基因，其中结构基因E gene、S gene等用来做筛选检测，而非结构基因orf1a、orf1b等用来做验证检测[7]。例如，Corman等[15]设计了针对RdRP、E和N基因的三重PCR检测方法，其结果显示RdRP基因检测的灵敏度最高(3.8 copies/reaction)。但在检测多种临床样本时，该方法的阳性检出率不高(28.2%)。为了提高检出率，Chan等[16]设计了针对RdRp/Hel、S和N基因的检测方法，相比于检测RdRP、E gene和N gene，该方法的检出率显著提高。但是，SARS-CoV-2在复制过程中易发生变异，这往往会降低PCR检测的准确性。为了找到SARS-CoV-2高度保守的序列以提高检测准确性，Yip等[17]分析了SARS-CoV-2基因组，发现nsp-2基因符合保守性和病毒特异性要求，并首次以nsp-2基因为靶标检测SARS-CoV-2。该方法在保证特异性及与Chan的方法相同灵敏度的同时，还缩短了检测时间，1 h即可出结果。

rt-qPCR可以满足SARS-CoV-2常规筛查的需求，但对于病毒载量较低的样本(如康复期患者)，其检出率并不能令人满意。因此临床上还需要灵敏度更高的方法针对这些特定样本进行检测。

2 微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)

ddPCR是Kinzler和Vogelstein于1999年提出的一种核酸定量检测技术，属于第三代PCR技术[12]。与第二代相比，ddPCR在靶标的绝对定量检测方面具有更高的准确性和灵敏度[18-20]。目前，ddPCR已经在肿瘤突变基因检测、病原体检测等领域中发挥重要作用[21-23]。

2.1ddPCR原理ddPCR通常包括样本分散、扩增、定量检测3个过程[12]。首先将待测样本送入仪器中微滴化处理，其中的靶标被分散到数千乃至数万个纳升/皮升级的液滴中，每个液滴含有0或1条模板。若分散不均，某些液滴则包含两条及以上的模板。随后对所有液滴进行PCR扩增并检测每个微滴的荧光信号。扩增前含有1条及以上模板的微滴信号为“1”(阳性)，不含模板的微滴信号为“0”(阴性)。根据阳性微滴的比例和泊松分布原理可以计算得到样品中初始目标模板的拷贝数[24]。

2.2ddPCR相对于传统qPCR的优势

2.2.1ddPCR具有高灵敏度与传统的qPCR不同，ddPCR是通过对每一条模板“单分子扩增”产生的信号进行分析来实现定量的，因此其灵敏度有了明显提升[25]。且样本分散时产生的液滴越多，体积越小，ddPCR的检测限越低，灵敏度越高。

2.2.2ddPCR对PCR抑制剂有更强的抵抗作用在提取待测核酸的过程中，往往会残留一些原来样本中的组分，如细菌的某些蛋白、多糖等，这类成分对PCR有一定抑制作用。相比于传统的qPCR，ddPCR对这类抑制剂的抵抗作用更强。Dingle等[26]发现SDS和肝素对ddPCR的IC50高于qPCR，而EDTA对两种方法的抑制作用类似。ddPCR有更强的抗性可能是因为在样本分散过程中，抑制剂也被分散到各液滴中，成为“单分子”，相比于在完整体系中的反应，其抑制作用被削弱。

2.2.3ddPCR不需要标准品或对照品传统qPCR在进行核酸绝对定量检测时，需要提前制备一系列梯度稀释的标准品来绘制标准曲线。标准品对质量的要求极高，且检测前需要配置梯度稀释标准液，这样就容易引入人为误差[27]。另外，不同实验室使用的对照品往往不同，从而造成实验参考性、重复性差的问题。但ddPCR不需要标准品即可进行绝对定量，从而有效避免了上述问题。

2.3ddPCR在SARS-CoV-2检测方面的应用SARS-CoV-2的传播途径主要是飞沫传播和接触传播，但仍有气溶胶传播的可能性。Liu等[28]利用ddPCR对医院等公共区域的空气样本进行新冠核酸检测后发现，在医院，ICU内的沉淀样本、方舱医院厕所的空气样本以及方舱医院医务人员区的空气样本检测呈阳性，其他区域几乎检测不到病毒核酸；在其他公共区域，发生过大规模人群聚集的区域病毒核酸浓度较高。这提示我们平时应注意对潜在的含病毒气溶胶的热点区域进行彻底消杀、保持医院通风状况良好并避免聚集。

新冠肺炎患者出院后发生的“复阳”现象引起了人们的关注。“复阳”现象的一个重要原因是康复期患者上呼吸道样本的病毒载量过低，常规RT-PCR无法检出[29-30]。Yu等[31]利用ddPCR对76位新冠肺炎患者的痰液、鼻拭子、咽拭子等样本进行检测后发现，症状明显期的患者痰液的病毒载量显著高于鼻咽拭子；而对于载量低于RT-PCR检测限的康复期样本，ddPCR仍可测出核酸拷贝数。此外，在RT-PCR测定为阴性的161例样本中，ddPCR测出4例为阳性；而RT-PCR测定为单基因阳性的67例样本中，ddPCR测出41例为阳性，这表明ddPCR能纠正RT-PCR检测的结果。

目前美国的Bio-Rad、Gnomegen公司和法国的Stilla公司已经开发出了基于ddPCR原理进行新冠检测的试剂盒，其中方法灵敏度最高的Gnomegen公司检出限(LOD)可达0.17 copies/μL。但ddPCR检测对仪器设备要求较高，操作复杂，检测时间较长，这些问题限制了ddPCR在临床上的应用。因此，即时、快速、准确的SARS-CoV-2检测方法可以更好的满足临床的需求。

3 基于PCR的现场快速检验技术(point-of-care test，POCT)

POCT，又称床旁检测技术、即时检测技术，是一种在采样现场进行的、利用便携式分析仪器快速得到检测结果的一种检测方式[32]。在病原体检测方面，相比于传统的检测方式，POCT具有检测速度快、不受场地限制等优点，因此在应对大规模传染病爆发时，POCT具有重要应用价值[33-34]。目前美国的Mesa Biotech、Cephied公司，德国的QIAGEN公司，国内的圣湘等公司已经开发出了基于PCR原理的新冠POCT设备。其中Mesa Biotech和圣湘公司最快仅需30 min即可完成检测。

在新冠肺炎检测中，POCT不仅可以加快检测速度，还可以避免检测人员与患者的接触、减低降低感染风险。目前国内新冠肺炎检测的场所主要是医院和第三方检测机构，检测人员需要直接面对待测人员进行取样。尽管有防护措施，但直面患者取样依然会增加检测人员感染的风险。因此很多机构研发出了供人们在家取样的试剂盒。Radbel等[35]在2020年5月初研发出一套用于唾液收集与检测的方法，该方法允许患者在家收集唾液样本。收集好样本后，患者需要将样本寄送到已受美国临床实验室改进法案修正案(CLIA)认证的实验室中，进行检测。家庭采样可以为患者的采样提供便利，提高的检测效率，还能减少人们去医疗机构的次数，避免发生交叉感染。

POCT虽然可以提高SARS-CoV-2检测效率，但一次只能检测SARS-CoV-2一种病原体。而临床上还有很多与新冠肺炎症状类似的病原体感染。因此同时检测多种病原体并对SARS-CoV-2做出区分具有重要的临床意义。

4 多重PCR

多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的一种可同时检测多种病原体的核酸检测技术。通过在单管中加入多种病原体的特异性引物和荧光探针，多重PCR即可对体系中存在的多种病原体基因组片段同时进行扩增检测。相比于单靶标PCR，多重PCR提高了待测靶标的通量，在临床和科研中发挥着巨大作用[36-39]。

4.1多重PCR原理熔解曲线法的原理是：在同一个反应体系中加入多个靶标的引物和相应的荧光

探针。如果体系中存在与某条探针互补的靶标，则扩增后该探针因消耗完毕而不产生熔解曲线。因此通过分析扩增后的熔解曲线可以得知原先存在哪些目标序列[37]。见图1。

4.2多重PCR在SARS-CoV-2检测方面的应用新冠肺炎疫情发生于2019年12月，这个时段也是其他多种呼吸道病毒感染的高发期，如流感病毒、副流感病毒、腺病毒等，而且新冠肺炎患者的临床表现与这些呼吸道疾病患者很相似[40]。在这种情况下，临床上非常需要能够快速、准确鉴别多种病原体，并将SARS-CoV-2与其他常见呼吸道病毒区分开的检测方法。但传统的PCR方法一次只能检测一种病原体，限制了临床诊断的速度，因此多重PCR近年来一直被用于呼吸道多重病原体联合检测，对感染类疾病监控、分流诊疗有着长远的指导意义[41]。目前美国的Luminex公司，法国的BioMérieux，国内的捷诺生物、达安基因等公司已经开发出了基于多重PCR原理的新冠检测试剂盒。其中捷诺生物、Luminex、BioMérieux最多可同时检测22种不同的病原体。

5 结 语

在新冠疫情检测方法中，基于PCR的荧光定量PCR、数字PCR、多重PCR等诊断技术各有优缺点，适用于不同的条件。实时荧光定量PCR发展最为成熟，在临床检测中最为常用。在医院、第三方检测机构等有生物安全防护条件的场所，荧光定量PCR是SARS-CoV-2检测的“主力军”；但其检测效率受假阴性制约，检出率只有30%～50%。数字PCR可定量检测病毒拷贝数，且灵敏度高于荧光定量PCR，对于康复期患者低病毒载量的上呼吸道样本，数字PCR仍可检出SARS-CoV-2；但其检测成本高，操作复杂，难以普及。多重PCR可实现多重病原体联检，对感染类疾病监控、分流诊疗有着长远的指导意义，但对仪器的要求较高，在基层医疗机构难以推广。POCT检测速度快，操作简便，可以在家中、车站等无生物安全防护条件的场所进行检测，但目前上市的POCT检测仪器数量有限，且价格昂贵，难以普及。

目前全世界范围内，新冠肺炎疫情仍未消退，其诊断方法仍是当下研究的重点，未来我们仍需要高灵敏度、高特异性、低成本、易操作、时间短的诊断方法。相信随着研究的不断深入，新型诊断技术会不断满足临床需求，为患者生命健康保驾护航。