外泌体在卵巢癌诊疗中的研究进展

罗艳露 范江涛 杨家湟

根据国家癌症中心2019年发布的数据，卵巢癌死亡率位居全国女性癌症死亡率的前十位，被称为肿瘤的“隐形杀手”，其恶性程度高及预后较差。目前大部分卵巢癌患者临床确诊时已为晚期，治疗手段包括手术、化疗、放疗及靶向治疗等，但卵巢癌易复发，约2/3晚期患者最终死于复发耐药，因此其早期诊断、靶向治疗是临床研究的难点与热点。外泌体作为信号载体参与多种疾病的发生发展过程，目前认为其发挥作用的方式主要为直接识别靶细胞表面的信号分子，通过与受体结合进行细胞间信息的传递；通过与靶细胞融合并释放其内容物，实现信息转运；通过释放其携带的信号分子作用于靶细胞表面受体，完成信息传递。近年来学者们对外泌体的生物学功能及其在临床中的应用进行不断探索，对外泌体的认识逐渐深入和全面。目前研究显示外泌体在卵巢癌的临床诊疗面临较大挑战，同时也蕴含巨大的应用前景。

1 外泌体的生物学功能

外泌体由多种活性细胞分泌，是直径为30～150 nm的具有双层膜结构的生物活性囊泡，其成分由分泌细胞包含的生物活性物质构成，包括核酸、蛋白质和脂类等。外泌体表面富含胆固醇、甘油二脂、鞘脂、磷脂等脂类物质，不仅可以维持外泌体的形态，使其稳定存在于血清、尿液、子宫内膜液、阴道分泌物、腹水等体液中，还可以作为信号分子参与多种生物学过程［1］。外泌体的蛋白质成分可以分为非特异性及特异性两类，非特异性蛋白指几乎所有外泌体均含有的蛋白，可用于区别其他类型的囊泡；特异性蛋白是由特定细胞分泌的外泌体上特有的，可用于鉴定疾病，有较高的临床实用价值，也是目前研究的重点。外泌体内的核酸包括DNA和RNA，在靶细胞内起作用的主要是RNA，外泌体内的RNA主要包括mRNA、microRNA（miRNA）和LncRNA，其中miRNA属于功能性RNA，可以调节细胞内的RNA和蛋白水平，从而影响细胞形态和功能，且这些外泌体中的RNA往往与疾病发生发展有关。因此，miRNA是外泌体中研究最广泛也是最深入的RNA。

目前认为外泌体的生物学功能包括物质传递、信息交流、细胞增殖分化、血管生成、免疫调节等，在肿瘤发生发展、侵袭、转移、预后等过程中起重要的调控作用。肿瘤细胞较正常细胞分泌更多的外泌体，来源母细胞不同，所分泌的外泌体量与成分也不同。有研究证实肿瘤细胞源性外泌体（tumor⁃derived exosomes，TEXs）能表达多种免疫抑制因子，并通过携带各类信号分子诱导肿瘤相关成纤维细胞、免疫抑制细胞生成，进一步参与血管生成、免疫调节、肿瘤细胞增殖与转移形成等病理过程［2］，在肿瘤微环境调控中发挥重要作用。肿瘤外泌体具有免疫调节特性，可以诱导肿瘤细胞产生免疫抑制功能以及协助肿瘤细胞逃避免疫系统监视，促进肿瘤进展。外泌体还可以通过转运与肿瘤血管新生相关的转录调节分子从而促进肿瘤血管生成，进一步促进肿瘤的发生发展。另外，外泌体在肿瘤细胞的增殖过程中发挥重要作用，肿瘤细胞通过外泌体影响非肿瘤细胞的肿瘤微环境形成，从而促进肿瘤的生长和增殖。因此，探索外泌体的生物学功能及其作用机制有望为肿瘤的防治提供新策略、新思路。

2 外泌体与卵巢癌

2.1 外泌体在卵巢癌诊断中的应用

研究发现卵巢癌患者外泌体在数量和蛋白含量上与正常人群存在显著差异，例如卵巢癌患者血清外泌体内的转化生长因子⁃β1（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）和黑色素瘤抗原⁃3/6抗原（melanoma anti⁃gen3/6，MAGE⁃3/6）的表达较良性肿瘤患者明显增多［3⁃4］。LIANG等［5］研究表明外泌体蛋白在与致癌作用相关的信号通路中高度富集，许多蛋白质在组织和外泌体中过表达，包括TUBB3、EpCAM、CLDN3、PCNA、EGFR、APOE、FASN等。ZHANG等［6］对上皮性卵巢癌患者的血浆外泌体进行蛋白质组学分析，并通过生物信息学分析发现外泌体GSN、FGG、FGA和LBP在卵巢癌血浆中显著差异性表达，因此推测外泌体中的这些差异性表达分子可作为卵巢癌潜在的诊断标志物。目前在临床实践中，不乏诊断卵巢癌标志物，但其敏感度和特异度仍不够，因此亟需发现其他具有高灵敏度和高特异度的生物标志物。CHEN等［7］分析了55例卵巢癌患者、33例恶性肿瘤患者（非卵巢癌组）和55例正常对照者血清及其衍生的外泌体中CA125和HE4表达的变化及其相关性，发现CA125在外泌体中的检测水平高于在血清中的检测水平；比较血清HE4、血清CA125、外泌体CA125和血清HE4联合外泌体CA125在卵巢癌中的诊断效果，结果显示血清外泌体来源的CA125显著提高了卵巢癌诊断的敏感度，血清HE4联合外泌体CA125组合显著提高了卵巢癌诊断效率（AUC为0.9861，灵敏度和特异度分别为96.36%和92.73%）。随着诊断技术的进一步发展，外泌体成分检测方法也在不断创新。ZHANG等［8］利用ExoProfle芯片分析了20例卵巢癌患者血浆中循环的外泌体，发现了具备诊断能力的7种生物标志物，包括HER2、EGFR、FRα、CA⁃125、EpCAM、CD24和（CD9+CD63），并证明这些外泌体生物性标志物不仅能区分卵巢癌患者与良性受试者，还能区分早期和晚期卵巢癌，展现了外泌体作为诊断卵巢癌生物学标志物的巨大潜力。ZHAO等［9］使用微流体方法（ExoS⁃earch）对15例卵巢癌患者及5名健康对照者的原始血浆进行外泌体的定量检测，并将外泌体中的CA⁃125、EpCAM和CD24进行标记，结果发现卵巢癌患者血浆中这3种外泌体肿瘤标志物的表达水平均高于健康对照组，还证实通过ExoSearch技术结合CA⁃125、EpCAM和CD24表达情况对卵巢癌进行诊断的准确性，与标准的Bradford分析诊断准确性相当。但ExoSearch技术历时更短，因此认为通过ExoSearch技术检测这3种组合外泌体标志物可以为卵巢癌的早期诊断提供理想的诊断准确性。也有学者提出血液中的外泌体存在特异性miRNAs，可以作为早期诊断卵巢癌标志物。YOSHIMURA等［10］在卵巢癌外泌体微阵列研究中发现包括miR⁃99a⁃5p在内的miRNA明显升高，卵巢癌患者血清miR⁃99a⁃5p水平是良性肿瘤患者的1.7倍和健康志愿者的2.8倍，诊断卵巢癌的特异度为 0.75，灵敏度为0.85，说明 miR⁃99a⁃5p可作为早期诊断卵巢癌的潜在标志物。综上研究可以看出，目前科研人员倾向于测量血清外泌体成分，以其特异性表达组分作为卵巢癌诊断手段，可行性强，但其诊断特异度及灵敏度仍需继续探索。此外，外泌体的组成成分复杂多样，其提取方式及检测手段尚无最佳标准，增加了应用于临床诊疗难度，但外泌体潜在的应用价值仍较具吸引力，有望作为卵巢癌诊断新手段。

2.2 外泌体在卵巢癌预后评估中的应用

外泌体不仅具有早期诊断价值，在人类多种肿瘤预后评估中也表现出一定优势。目前关于外泌体作为卵巢癌预后评估标志物的报道还较少，学者们认为大多数具有诊断卵巢癌潜力的外泌体同样也具备评估其预后的能力，但其特异度及灵敏度仍需进一步探索。MENG等［11］对比163例上皮性卵巢癌患者血清中外泌体的 miR⁃373、miR⁃200a、miR⁃200b和 miR⁃200c表达情况，发现4种外泌体miRNA浓度均高于健康对照者，且miR⁃200c和miR⁃200b表达水平升高与较短的总生存期有关，可以作为评估卵巢癌预后的潜在标志物。这一研究结果与ZUBERI等［12］的研究结果一致。此外，QIU等［13］检测血清外泌体MALAT1的表达情况，发现上皮性卵巢癌患者的血清外泌体MALAT1表达水平明显高于对照组，且其高表达水平与FIGO分期晚期、高组织学分级和淋巴结转移相关，血清外泌体MALAT1表达水平高的患者较表达水平低的患者具有更短的总体生存时间，表明血清外泌体MALAT1高表达与晚期转移性上皮性卵巢癌表型和不良预后相关，可作为上皮性卵巢癌预后预测生物标志物。TANG等［14］也发现血清外泌体aHIF在上皮性卵巢癌中过度表达，aHIF表达较高的患者总体生存较差，多因素Cox回归模型显示aHIF水平是上皮性卵巢癌的独立预后因素，而基于aHIF建立的列线图模型对上皮性卵巢癌患者也具有良好的预测能力，因此认为外泌体可作为评估预后的无创预测生物标志物。综上所述，外泌体作为卵巢癌预后评估的生物学标志物蕴含巨大前景，未来需要更多、更深入的研究证实其临床应用的安全性及可行性。

2.3 外泌体在卵巢癌治疗中的应用

2.3.1 外泌体作为卵巢癌的治疗靶点 随着对外泌体研究不断深入，目前认为外泌体在卵巢癌治疗中具有潜在的应用价值，包括在卵巢癌抗化疗耐药性、肿瘤转移、靶点治疗以及改善临床疗效等方面。KALPANA等［15］发现在顺铂治疗过程中将缺氧性卵巢癌细胞系外泌体（HEx）与肿瘤细胞共培养可提高细胞存活率，而用已知的抑制剂Amiloride或STAT3阻止外泌体释放，并用顺铂治疗可导致细胞凋亡显著增加，提示HEx可以促进卵巢癌转移和提高化疗耐药性，可以作为肿瘤转移、化疗耐药性的新机制以及改善临床疗效的干预手段。NAKAMURA等［16］研究则发现GW4869可抑制晚期卵巢癌细胞外泌体释放，并通过减弱人腹膜间皮细胞中CD44的表达和逆转上皮⁃间充质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）抑制卵巢癌侵袭。显示了外泌体作为晚期卵巢癌新型辅助剂治疗策略的潜在用途。此外，YOSHIMURA等［10］发现在卵巢癌患者血清中表达水平明显升高的外泌体miR⁃99a⁃5p可以通过感染邻近的人腹膜间皮细胞，从而促进癌细胞侵袭纤连蛋白和玻连蛋白上调，证实外泌miR⁃99a⁃5p可以作为抑制卵巢癌进展的靶标。还有研究［17］发现来自脂肪间充质干细胞的外泌体可以通过阻断细胞周期和激活线粒体介导的凋亡信号抑制A2780人卵巢癌细胞增殖，同样显示了外泌体miR⁃NAs在这一抑制途径中的重要性，为卵巢癌的研究和治疗提供新的进展。

2.3.2 外泌体作为药物载体用于卵巢癌治疗 外泌体具有稳定的双分子脂膜结构，使其在体内循环中具备较高的耐受性，加上较长的循环半衰期、低毒性或无毒性、固有的针对特定组织甚至细胞的能力、低免疫原性和固有的归巢能力等［18］，外泌体也可以通过基因工程穿过生物障碍（如血脑屏障），并携带多种药物分子和基因（如蛋白质、脂质、核糖核酸和脱氧核糖核酸），渗透到组织中，从而有效地防止它们降解［19］，因此外泌体也有望成为一种新型有效的药物传递系统。REZA等［17］研究发现脂肪间充质干细胞外泌体通过传递miRNA可降低A2780卵巢癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，表明外泌体作为传递工具可以应用于卵巢癌的治疗。FARRUKH等［20］通过外泌体传递花青素（anthocyan）作用于卵巢癌细胞，也发现花青素的外泌体制剂对药物敏感和耐药的人卵巢癌细胞均具有较强的治疗作用，且与顺铂联合使用能协同提高其治疗活性。还有研究发现加载雷公藤（tripterygi⁃um wilfordii Hook.f.）的外泌体可抑制卵巢癌细胞增殖以及肿瘤生长，具有较好的肿瘤治疗潜力［21］。YUE等［22］将负载多柔比星（doxorubicin，Dox）的IRGD外泌体静脉注射到卵巢癌小鼠体内，观察小鼠体内成瘤情况，结果发现IRG外泌体⁃Dox组小鼠的肿瘤体积明显小于PBS组、外泌体组、Dox组和空白⁃外泌体⁃Dox组，显示了基于多功能外泌体的药物载体构建在抗肿瘤治疗中具有良好的应用价值。以上研究结果提示治疗性外泌体可以应用于抑制卵巢癌细胞增殖，尽管其临床应用仍面临许多挑战，如大规模生产、细胞来源及其对靶细胞的特异性，但工程外泌体仍是治疗卵巢癌有前途的治疗策略。

3 小结

外泌体的发现及深入研究在卵巢癌诊疗中发挥了重要作用，其独特的生物学优势为卵巢癌的早期诊断、预后评估、靶向载药、提高药效等提供新思路，但将其应用于临床也面临诸多难题，例如外泌体提取与鉴定技术尚不足，给药途径及频次选择的尚无最佳统一标准，以及如何提高治疗靶向性，不良反应研究等，这些问题都需要未来进一步更深入研究探索，才能使外泌体更好地应用于卵巢癌诊疗。