磷酸镁骨水泥缓凝改性及其生物医学应用进展

龚长天，郭卫春

(武汉大学人民医院骨外科，武汉430060)

创伤、肿瘤等因素导致的大块骨缺损是困扰骨科医师的临床难题，其定义为超过长骨直径1.5倍的骨缺损［1］。骨移植被认为是大块骨缺损治疗的金标准，然而自体骨移植供区骨量有限，异体骨移植有潜在疾病传播、经济负担较重等问题［2］。近年来人工合成材料常被用于大块骨缺损的治疗。聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥因具有较高机械强度、术中易于成型等优点常用于椎体成形术中，但聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥自固化过程放出的高热会引起缺损处二次损伤，而且单体具有细胞毒性、植入部位易形成界面松动，以上缺点限制了其临床应用［3］。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate bone cement，CPC)的主要成分与天然骨无机相类似，兼具良好的生物相容性、骨传导性，但CPC机械强度较低，同时不具备骨诱导功能，难以形成缺损处新骨爬行替代［4］。为解决CPC体系中现存的问题，研究者开发了衍生的磷酸镁骨水泥(magnesium phosphate bone cement，MPC)。MPC在水化反应早期具备高抗压强度，术中可快速凝固，其主要产物磷酸镁盐具有良好的生物相容性，可于内环境中生物降解，另外添加改性物质后的复合MPC能够满足多样化的临床需求［5］。现就MPC体系改性策略及其在生物医学领域中的应用进展进行综述。

1 MPC体系简介

MPC由固相和液相构成，固相以高温煅烧氧化镁、磷酸盐粉末为主体，液相以纯水等固化液为主体，固液两相在室温条件下以一定比例均匀混合后可制备MPC，MPC各组分间的性质与配比共同决定了MPC的理化性质及生物学性能［6］。MPC的固化反应是一种快速水化离子反应，为MPC早期提供了早期高抗压强度，但在反应的同时会释放大量的热，不利于MPC的生物医学应用，因此MPC体系中需要缓凝剂降低峰值温度、延长放热时间，为临床操作提供合适的时间窗［7］。

2 改性缓凝剂种类及其添加策略

2.1 常见改性缓凝剂种类

2.1.1 生物活性物质 生物活性物质是指具备功能性基团的有机物，能在MPC体系中发挥缓凝作用的同时提高生物相容性［8］。生物活性物质常选择在骨水泥液相中具有一定溶解度的物质，能在水化反应中与氧化镁发生竞争性溶解，减缓镁离子(Mg2+)及氢氧根的释放速率，从而发挥缓凝作用。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，其分子链上的氨基及羧基使其具备促成骨细胞分化、增殖的能力。Liao等［9］将一定质量分数壳聚糖加入MPC体系中制备了壳聚糖MPC，结果显示0.2%～2%添加含量的壳聚糖MPC抗压强度为45～170 Mpa，凝结时间为12～20 min，抗溃散性较MPC大大提高。其原因可能是主要水化产物磷酸镁铵晶体包裹在氨基与Mg2+之间形成的桥式聚合物网络结构中，形成致密结构，最终提高抗压强度及抗溃散性，但该研究未深入讨论壳聚糖MPC的生物学表现。Kim等［10］使用茚二酮(indene，KR34893)与3D打印技术联合制备了KR－MPC，重点关注了KR－MPC的生物学性能，实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot等结果显示人骨髓间充质干细胞和小鼠成骨细胞(MC3T3－E1)中矿物质沉积和成骨细胞标记基因(Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、人Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白)的体外表达显著升高。SD大鼠颅骨缺损结果表明，与对照组MPC相比，KR－MPC能更好地促进骨再生。

细胞因子类物质是由细胞分泌的具有特殊生物学功能的小分子蛋白质，近年来也被用于MPC的改性［11］。细胞因子类物质的生物学功能与构象相对应，MPC水化反应产生的高热对其构象有潜在损伤，因此目前研究常使用细胞因子类物质对预成型后的MPC进行修饰，以获得具备最佳生物学表现的复合MPC。骨形态发生蛋白是存在于多种细胞生理行为中的功能再生因子，尤其在骨缺损修复中起重要作用［12］。Ding等［13］使用重组人骨形态发生蛋白－2(recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP－2)对固化后MPC样品进行了修饰，与CPC/rhBMP－2相比，MPC/rhBMP－2复合支架的体外成骨分化和磷酸化显著增强，其生物活性增强的潜在机制是Mg2+通过Smad信号通路促进rhBMP－2的表达水平升高，继而增强MPC体外成骨诱导分化能力;动物实验也印证了以上结论，植入8周后的微型CT结果证实CPC/rhBMP－2和MCPC/rhBMP－2均被新生骨组织包裹，且后者周围形成了更多的新生骨组织。

2.1.2 无机非金属物质 MPC在研究早期常被用作提高CPC体系机械强度的添加物，近年来才作为骨水泥主体进行大量实验研究，所以MPC体系常选用CPC进行体系合并，本质上是调整了两者之间的比例［14］。大多数CPC的凝结时间远长于MPC，体系合并后的复合MPC峰值温度下降、放热反应时间延长，拓展了其生物医学应用范围;另外由于两者的反应机制相近，复合MPC的机械性能获得较大提升。Yu等［15］向MPC中加入了一定质量分数(0%～65%)的磷酸二氢钙制备了磷酸钙镁骨水泥(calciummagnesium phosphate bone cement，CMPC)，结果表明CMPC凝固时间延长(0%～65%，6～18 min)，抗压强度呈现先增大后减小的变化趋势，40%含量组最高可达31.2 Mpa;此外复合CMPC可于三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中体外降解。CMPC浸提液的细胞毒性测试也证明CMPC具有良好的生物相容性。Liu等［16］使用生物活性α－磷酸三钙(α－tricalcium phosphate，α－TCP)对MPC进行改性，结果表明α－TCP的引入使MPC的早期强度略有降低，7 d后MPC抗压强度增加;当α－TCP添加含量为8%时，抗压强度可达68 MPa。体外于纯水和模拟体液中浸泡56 d后α－TCP－MPC组的剩余抗压强度及质量显著高于MPC组。同时新西兰白兔股骨髁植入实验表明α－TCP－MPC组植入部位周围组织未见炎症细胞聚集及病理改变，12周后材料组织交界区域有明显胶原沉积，α－TCP－MPC组周围部分新生骨已改建为成熟骨组织且新生骨量高于MPC组。可见，α－TCP－MPC不仅可在体内生物降解，还具备良好的骨诱导能力，诱导缺损处新生骨的自身替代。

2.2 改性策略 改性策略的选择要点主要集中于添加方式与添加含量［17］。MPC体系由固液两相构成，同种物质可分别由固相液相添加，另外添加含量也影响MPC的整体表现。Yu等［18］和Wang等［19］将磷酸二氢钙与柠檬酸加入MPC中进行改性，其中柠檬酸从固液两相分别添加，结果显示在主要产物相成分未改变的前提下，固相添加使MPC的凝结时间更长、早期抗压强度更强、孔隙率更高。其原因可能是固相添加时柠檬酸在水化反应过程中存在溶解过程，延后了作用时间，使水化反应更加彻底，主要产物的磷酸镁盐含量增加。但两种添加方式细胞水平生物表现无明显差异，柠檬酸中包含的功能性基团均使MPC生物相容性提高，说明添加方式主要影响MPC基础物化性质，尤其是对于生物相容性的影响相对较小，生物相容性的变化主要与物质种类相关。MPC体系的最大改性物质容纳量为10%左右，最佳添加含量为5%左右，这为MPC体系中新改性物质初始添加含量的选择提供了理论依据。Yu等［20］将不同比例的羧甲基壳聚糖(0%～10%)加入MPC中制备了新型可注射复合羧甲基壳聚糖/CMPC，分别对CMPC的物化性质、显微结构及其表面成骨细胞的黏附、增殖和分化情况进行了评价。结果显示，与MPC相比，CMPC凝固时间较长，凝固温度较低;含5%羧甲基壳聚糖的CMPC抗压强度和抗冲蚀性能最高;成骨细胞在CMPC标本上的黏附、增殖和分化程度均优于MPC，且5%添加含量组综合性能最佳。曹霄峰等［21］分别使用2%、6%、10%质量分数的胶原肽对MPC进行改性，结果表明MPC水化反应峰值温度由63℃下降到50℃(10%)，同时放热峰出现时间延后200 s;适量的胶原肽在不改变MPC体系主要产物物相的前提下，对复合骨水泥具有良好的缓凝作用(8 min)，同时能够提高复合骨水泥的抗压强度(6%，39.5 Mpa)，但进一步提高胶原肽的含量会降低复合骨水泥的抗压强度(10%，28 Mpa)。体外细胞实验结果表明，胶原肽的加入可促进MC3T3－E1细胞和L929细胞的增殖，且无明显细胞毒性。

3 MPC的应用进展

3.1 炎症治疗 骨髓炎是青少年骨科常见疾病，也是导致青少年骨缺损的主要原因之一［22］。由于MPC同时具备载抗生素及生物降解能力，能为感染区域局部递送抗生素的同时减少全身耐药事件的发生，近年来得到广泛关注［23］。金黄色葡萄球菌是常见骨髓炎致病菌，特异性针对金黄色葡萄球菌的抗生素骨水泥目前尚不多见［24］。Mestres等［25］通过新西兰白兔股骨骨髓炎模型系统评价了不同配方抗菌骨水泥治疗骨髓炎的效能，共选取了5种骨水泥进行评估:无孔及大孔载多西环素的CPC、以上两者的非载药空白对照以及无孔不含多西环素的MPC。金黄色葡萄球菌体外生长实验结果显示，大孔载药CPC组抗菌效果最佳，其原因是大孔隙结构相对表面积最大，利于液体交换及成骨细胞的增殖、血管化，增加了多西环素的局部释放速率，提高了多西环素的局部浓度。MPC组显示出了仅次于大孔载药CPC组的抗菌效果，说明MPC在无孔且不负载多西环素的情况下即可发挥抗菌作用，这可能与MPC主要降解产物呈碱性相关。Cabrejos－Azama等［26］将Mg2+掺杂入钙磷石中制备复合TCP－MPC，体外探究其对金黄色葡萄球菌感染的治疗效果，结果显示万古霉素的持续释放依赖于水泥基质中Mg2+浓度，且26%Mg2+负载TCP－MPC抗菌性能最佳，有助于预防骨再生过程中的感染。

3.2 3D打印 3D打印技术是一项新兴的数字化快速成型技术，在计算机辅助下，以物体的几何参数为基础，利用相关打印材料，能够高精度构造复杂结构的物理模型［27］。3D打印技术在个性化治疗骨缺损中价值巨大，尤其是不规则骨缺损的重建，近年来受到广泛关注［28］。具有良好可塑性的生物陶瓷材料是常用的3D打印材料，其主要优点在于成分类似于天然骨无机成分，具有优良的抗压强度、骨传导等性能，同时还有良好的生物降解及较强的生物相容性，MPC是其中常见的打印材料之一［29］。Klammert等［30］采用新型两步法室温3D打印制备了三维多孔MPC支架，该方法可在制备三维支架的同时负载生物活性物质。与传统先烧结后修饰工艺相比，该工艺大大提高了缓释载药效率及性能。体外细胞实验结果显示，MPC支架材料不仅具有良好的三维互联孔结构、力学性能、可降解性，还具有良好的细胞黏附性能和体外生物相容性，满足了理想的支架材料用于硬组织再生的条件。锶离子(Sr2+)可以预防骨质疏松症并促进骨形成，在骨生物材料领域具有良好的应用前景［31］。Meininger等［32］利用3D打印粉末、高温烧结和(或)化学转化等3D打印技术制备了Sr2+取代Mg3(PO4)2的型生物降解MPC。结果表明，新型MPC的平均抗压强度为36.7 MPa、抗弯强度为24.2 MPa、拉伸强度为10.7 MPa，能够满足骨缺损修复材料的基础参数需求。CT则揭示了复合支架具有高度互联的多孔结构与正态分布的三维孔隙，其孔隙大小为17.74～26.29μm。此外，体外离子释放研究结果显示Mg2+释放减少，而Sr2+可以缓慢而稳定地从复合支架中连续释放。Golafshan等［33］则利用Sr2+、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)和磷酸镁陶瓷(magnesium phosphate ceramics，MgP)通过挤压辅助3D打印法制备了掺锶复合PCL－MgPSr支架，实验结果表明含有30%质量分数PCL的MgPSr支架大孔隙率约40%，抗压强度为4.3 MPa，同时MgPSr－PCL30支架无需补充骨诱导成分即可在体外诱导新骨生成。此外，马髋臼大块骨缺损模型的微型CT及组织学分析结果表明MgPSr－PCL30支架可在体内稳定降解6个月，同时可诱导骨再生填补缺损处。

3.3 仿生成孔 天然骨组织具备3D多孔结构，利于局部物质交换及新陈代谢［34］。研究者在MPC的开发中也借鉴了此类3D结构的优点。目前最常使用的方法是向骨水泥配方中加入具备一定粒径的可溶性惰性成孔剂，利用成孔剂与MPC之间的溶解度差异制造孔隙结构。可溶性惰性成孔剂的优点在于成本较低且孔隙大小易于控制，但在孔隙比例和孔隙分布上具有一定的随机性，过多的孔隙及其在骨水泥内部的非均匀排列会导致机械强度的过度损失，寻找合适的平衡点仍是一个难题。Wei等［35］将不同粒径氯化钠晶体作为成孔剂分别制备了微孔及大孔MPC，以探究孔隙大小对MPC机械强度和生物学性能的影响，结果显示大孔MPC组的体外降解速率高于微孔组，MG63细胞的黏附、增殖、分化率及碱性磷酸酶活性均高于微孔组，同时兔股骨髁缺损模型也验证了以上结论，大孔MPC组植入3个月后的缺损区域新生骨面积显著增加。提高生物相容性的代价是大孔MPC组的机械强度损失，平均抗压强度仅为8.62 Mpa，远低于皮质骨的抗压强度，难以满足临床需求。

3.4 新型可吸收椎间融合器 脊柱退行性病变保守治疗效果不佳后常选择脊柱融合作为治疗方法。近年来椎间融合器在脊柱外科中广泛使用，椎间融合器不仅可以提高融合椎体间的稳定性，还可以在限制移植骨活动范围的同时恢复椎间隙高度和体积，降低椎间盘内压力、减少疼痛事件的发生［36］。为解决当前椎间融合器存在的应力遮挡、不可吸收等问题，韩振川等［37］设计了一种MPC椎间融合器，并将已广泛应用于临床的聚醚醚酮椎间融合器作为对照组，结果表明MPC椎间融合器在承受相同外力时抵抗形变的能力明显强于聚醚醚酮椎间融合器，这是由MPC椎间融合器与周围组织化学键结合所致，MPC椎间融合器可兼具高机械强度和高体积稳定性。MPC椎间融合器具备治疗骨退行性病变的应用前景，但是当前缺少相关体内实验数据支撑，有待进一步研究。

4 小 结

MPC是一种基于微溶盐水化反应生成的无机非金属生物陶瓷材料，具有早期高强度、快速固化等特点，同时具有良好的生物相容性及生物降解性，因此近年来得到骨组织工程学研究者的重视。大量实验研究证明，MPC在具有满足骨组织工程基础机械性能的同时无细胞毒性及遗传毒性，另外在动物实验中也证明了MPC具有骨整合、骨传导、骨诱导性能，可通过相关信号通路促进间充质干细胞/成骨细胞的增殖、分化与黏附，最终在骨缺损处通过生物降解诱导形成新骨替代。另外不同种类的改性物质可加入MPC体系中，提高其物化性质和生物相容性。此外，MPC在3D打印、载药等方面也被成功应用。但MPC相关研究也存在不足之处，如不同研究间的基础配方差异较大，使用的细胞系及动物模型不同，结果不具备横向可比性，无法大规模量化评价MPC体系的整体性能。同时MPC研究水平尚不深入，分子机制水平的研究较少。