呼吸重叠综合征患者中性粒细胞凋亡机制的研究进展

李鑫，曹洁

(天津医科大学总医院呼吸与危重症医学科，天津300052)

呼吸重叠综合征(respiratory overlap syndrome，OS)是指慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)与阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea，OSA)并存，同时存在间歇性低氧或持续性低氧。COPD与OSA均是心血管疾病的独立危险因素。流行病学研究提示，明确诊断的OS患者占成年男性的1%［1］，但实际上无症状的睡眠呼吸障碍与COPD同时存在的概率更高。OS合并心血管疾病的发病机制复杂，目前尚不完全清楚。与单纯患有COPD或OSA的患者相比，OS患者夜间动脉血氧饱和度降低、日间低氧血症和高碳酸血症更为显著，且心血管改变更严重，包括肺动脉压力升高、恶性心律失常和心功能衰竭等［1］。血管内皮细胞功能受损是导致心血管疾病的直接原因，其中循环血白细胞与血管内皮细胞接触最多且最直接，而白细胞的存活情况和功能状态是导致内皮细胞功能障碍的主要细胞学机制［2］。多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)是人体主要的循环血白细胞，在宿主抵御病原体过程中起重要作用，但其存活时间延长会产生炎症损伤。研究发现，PMN存活时间延长导致其与血管内皮细胞间的相互作用时间增加，进而加重血管内皮细胞损伤，出现心血管合并症［3－6］。现就OS患者PMN凋亡的机制予以综述。

1 低氧条件下PMN凋亡的发生机制

PMN是一种寿命较短的效应细胞，若其存活时间延长则炎症的消退延迟。PMN可释放相应的酶和活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，导致周围组织受损。为了防止衰老的PMN释放有毒物质，在生理条件下，活化的PMN会迅速凋亡，即出现细胞膜斑点化、细胞体收缩、细胞质致密化、核染色质凝结、基因组被内切酶切割等一系列特征性的形态学变化;然后，凋亡的细胞被特异性的吞噬细胞(如组织巨噬细胞)识别、吞噬、清除，这种安全清除的机制可以维持PMN数量的稳定，减少其释放有害酶和ROS，因此PMN凋亡是调节其数量和功能的重要细胞过程，在维持PMN稳态和减少炎症损伤中发挥重要作用［7］。

PMN有内源性和外源性两条凋亡途径，即线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径。在内源性凋亡途径中，线粒体外膜通透性是凋亡的关键触发因素［4］。B细胞淋巴瘤/白血病－2(B－cell lymphoma/leukemia－2，Bcl－2)家族是一组与细胞凋亡调控密切相关的基因。Bcl－2基因家族包括促凋亡基因和抗凋亡基因，而促凋亡基因与抗凋亡基因的表达水平决定了细胞的存活，Bcl－2家族中的两个促凋亡蛋白Bcl－2相关X蛋白和Bcl－2同源拮抗物均可介导线粒体膜的通透性，参与凋亡小体的形成，诱导下游胱天蛋白酶(caspase)相关的级联反应，启动PMN内源性凋亡程序［8］。在外源性途径中，PMN凋亡是由细胞死亡受体复合物(包括Fas受体、肿瘤坏死因子受体Ⅰ和肿瘤坏死因子受体Ⅱ等)的交联启动。死亡受体与死亡相关蛋白结合后可以进一步结合初始caspase，形成凋亡信号转导复合物;初始caspase与死亡受体结合导致caspase－8前体分子聚集水解，进一步激活下游的caspase－3，caspase－3是细胞凋亡的末端效应器，可启动促凋亡程序;而肿瘤坏死因子受体Ⅰ可通过激活核因子κB(nuclear factor－κB，NF－κB)通路调控PMN凋亡，促进PMN存活［4］。

COPD以持续气流受限、肺泡壁破坏、PMN浸润和反复感染为主要特征。COPD的血管功能障碍可能是炎症损伤、内皮功能障碍和结缔组织退化等因素共同作用的结果。有证据表明，气道炎症是COPD患者气道重塑和肺泡实质破坏的核心，PMN释放ROS和丝氨酸蛋白酶(中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G以及基质金属蛋白酶等)导致肺泡破坏［9］。在COPD发病和全身多系统损伤过程中，慢性持续低氧起重要作用。在慢性缺氧情况下，NF－κB及其下游炎症通路、免疫通路被激活，引发一系列氧化应激和炎症反应。研究显示，在COPD患者的外周血中，PMN、血小板、黏附分子、炎症细胞因子和ROS的表达均显著增加［5］。Saetta等［10］研究发现，在COPD患者的大、小气道和肺实质中PMN和CD8+T淋巴细胞的表达均增加。另有研究发现，在COPD稳定期和急性加重期，诱导痰液和肺泡灌洗液中的PMN计数、PMN衍生酶水平均增加，PMN自发凋亡的百分率则显著降低;COPD症状的严重程度与肺泡灌洗液中PMN的活化直接相关，痰液中PMN的百分比与COPD呼吸困难评分及预后直接相关［7］。PMN凋亡减少和PMN功能障碍均与COPD患者预后不良相关［11］。COPD患者的PMN和相关炎症分子表达水平升高，进一步增加了PMN与内皮细胞的相互作用，促进血管损伤的发生［12］。

OSA是一种在睡眠过程中出现吸气和呼气容积受限并伴有间歇性低氧的睡眠呼吸障碍性疾病。OSA的血管损伤机制除交感神经兴奋、内皮功能障碍和代谢失调外，还包括缺氧、炎症和氧化应激［13］。OSA的缺氧模式是间歇性的，更易诱导ROS生成，进一步导致包括NF－κB在内的多种氧化应激和炎症反应信号通路的激活。NF－κB通路激活导致其下游产物(包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、黏附因子、趋化蛋白等)在组织和细胞中的生成增加［14］。而趋化蛋白、黏附因子、选择素和炎症因子的过表达可引起PMN凋亡延迟，并增加PMN与内皮细胞间的相互作用，诱发内皮细胞凋亡和损伤［15－16］。Rubinstein［17］发现，OSA患者鼻黏膜中的PMN百分比增加;Salerno等［18］研究发现，OSA患者诱导痰液中的PMN数量增加。

OS患者同时伴有上、下呼吸道阻塞，且多发生于肥胖人群。OSA的发病机制包括解剖因素(如上气道塌陷)和非解剖因素(上气道肌肉反应、睡眠中呼吸相关觉醒和呼吸中枢抑制)。OS患者中，COPD可通过多种机制影响OSA的发生，导致OS患者与单纯OSA、单纯CPPD患者在病理生理方面存在差异。OS患者在睡眠呼吸障碍发作期间也表现为间歇性低氧血症，但其夜间血氧饱和度降低更显著［19］。COPD、OSA单独存在均可能导致持续的炎症状态，而相关研究显示，OS患者全身和肺部炎症反应更显著，气道PMN数量增多，存在更严重的PMN凋亡延迟［19－20］。

在低氧环境下，PMN的凋亡在体内、外均受到严重抑制。低氧既可激活NF－κB通路，也可活化低氧诱导因子1(hypoxia－inducible factor－1，HIF－1)通路。研究发现，在持续低氧条件下，PMN凋亡主要通过HIF－1通路发挥调节细胞凋亡的作用;在间歇性低氧条件下，PMN凋亡主要通过NF－κB通路发挥抗细胞凋亡的作用;COPD与OSA患者均存在低氧，但两者的低氧模式存在本质区别，故导致PMN凋亡的分子机制也可能不同，与持续低氧相比，间歇性低氧对PMN凋亡的抑制作用更显著［21］。在OS患者中，间歇性低氧血症和持续性低氧血症均会出现，因此可同时激活NF－κB和HIF－1信号通路，并通过多种机制发生相互作用，进一步激活p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)通路，导致抗凋亡基因(如髓细胞白血病基因－1)的活化和PMN凋亡减少［22］。OS模式下，PMN凋亡受到抑制，黏附因子释放增加，PMN与血管内皮细胞间的相互作用增强，氧化应激和炎症反应加剧，进一步导致凝血因子活性增强、毛细血管阻塞，引起OS患者血管内皮功能障碍，导致心血管合并症加重［23－25］。因此，OS的不良影响可能是协同作用而不是叠加作用。

2 低氧条件下参与PMN凋亡调控的相关转录因子

低氧诱导下，PMN凋亡与多种调控因子作用密切相关。通常情况下，PMN同时暴露于促凋亡和抗凋亡因子中，促凋亡和抗凋亡因子的平衡决定了PMN的存活。但与其他细胞不同，持续性低氧和间歇性低氧在体外和体内均可显著抑制PMN凋亡。在低氧条件下，多种信号通路和调控分子被激活，参与PMN凋亡过程的调控。

2.1 NF－κB NF－κB可通过调节细胞因子和黏附分子的表达参与动脉粥样硬化的发生、发展。白细胞介素－8是PMN存活蛋白，可结合PMN表面的CXC趋化因子受体1和CXC趋化因子受体2，使PMN凋亡延迟［26］。NF－κB可作为基因的调控者，控制PMN存活基因Bcl－2家族的表达和白细胞介素的合成;在静息细胞中，NF－κB与其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor－κB，IκB)形成复合体，以无活性形式存在于胞质中;当细胞受到胞外信号刺激时，IκB激酶活化并将IκB磷酸化，使NF－κB暴露核定位位点，而游离的NF－κB迅速移位至细胞核与应答基因DNA的一致位点结合;PMN中的NF－κB活性调节机制与其他细胞最重要的区别为新合成的IκB可进入细胞核，从基因启动子中转运NF－κB至胞质［27］。研究发现，NF－κB介导的炎症反应与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、2型糖尿病等疾病的发生相关［28］。内皮细胞体外模型显示，间歇性低氧可激活NF－κB［29］。与单纯肥胖者相比，OSA患者的NF－κB活性和PMN表达水平均显著升高［30］。而持续正压通气可减少OSA患者肿瘤坏死因子、黏附分子、趋化蛋白等NF－κB靶基因的表达［31］。

2.2 HIF－1 HIF－1是一种由HIF－1α和HIF－1β亚基组成的异二聚体复合物，但主要通过HIF－1α亚基参与组织细胞对低氧环境的适应［32］。研究发现，HIF－1α在患者血清中的表达与OSA的发生、发展及其并发症的发生均相关［33］。在低氧环境下，细胞可通过磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B通路和MAPK通路增加HIF－1α的生成，并与HIF－1β形成稳定的异源二聚体结构［34］。作为信号转导的中枢，HIF－1α被激活后可诱导血管内皮生长因子、内皮素、促红细胞生成素以及诱导型一氧化氮合酶的生成，促进红细胞和循环系统血管内皮细胞增殖以及血管重塑，通过调节其下游相关产物的表达而发挥效应［32］。研究表明，在轻度缺氧时，HIF－1α发挥抑制细胞凋亡的作用;而在长期重度缺氧时，HIF－1α发挥诱导细胞凋亡的作用［35］。HIF－1α可能通过对p53、Bcl－2家族促凋亡和抗凋亡蛋白的调节发挥作用。caspase－3是死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径中凋亡信号转导的关键节点和连接点，是细胞凋亡信号的执行者。HIF－1α通路被抑制后，可增加细胞凋亡蛋白酶(caspase－9和caspase－3)的生成，进一步通过磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B通路改变Bcl－2家族促凋亡和抗凋亡基因的表达［21］。HIF－1α在不同细胞和组织中诱导细胞凋亡的机制也不同。有研究显示，在低氧环境中PMN凋亡的抑制取决于HIF－1α的活化［36－37］。Talla等［24］研究发现，在低氧条件下，人PMN的形态发生显著改变，胞质中出现许多新的空泡，其自发凋亡被抑制，存活时间延长;PMN凋亡的抑制与磷脂酰丝氨酸表达减少及caspase－3激活延迟相关，且伴随HIF－1α及其目标基因表达水平的升高;HIF－1的激活是调控PMN凋亡的重要组成部分，而应用二甲氧基巯基甘氨酸可以抑制这一过程，进一步延长PMN在低氧条件下的存活时间。

2.3 p38 MAPK p38 MAPK是另一个与PMN死亡相关的存活信号。p38 MAPK的激活可介导PMN凋亡，并参与低氧诱导的NF－κB活化，导致Bcl－2家族和白细胞介素－8过表达［38－39］。因此，应用p38 MAPK抑制剂可抑制NF－κB的活性。另外，p38 MAPK可降低细胞凋亡蛋白酶活性，导致其磷酸化，延缓PMN凋亡;同时，低氧条件下激活的p38 MAPK也可通过诱导Bcl－2家族抗凋亡基因髓细胞白血病基因－1的活化，延缓PMN凋亡［39］。在持续性低氧或间歇性低氧条件下，p38 MAPK通路均可发挥延缓细胞凋亡的作用，降低p38 MAPK活性则可下调低氧条件下PMN的存活率，故应用相关p38 MAPK抑制剂可促进PMN凋亡，达到治疗的目的［40］。

2.4 ROS ROS由过氧化氢、羟基自由基、单态氧等一系列不稳定分子组成。ROS是线粒体呼吸过程中产生的高活性分子，可作为信号分子在维持细胞功能和稳态中发挥重要作用。但ROS产生过多也会对蛋白质、脂质和核酸造成损伤，可引起氧化损伤或诱导细胞凋亡。ROS介导的氧化还原信号通路受各种分子和翻译后修饰的严格调控，而ROS信号失调可导致细胞功能失调，进而导致各种病变(如肿瘤、炎症性疾病和神经退行性变)的发生［41－42］。有研究发现，COPD和OSA的氧化应激损伤均与ROS的产生密切相关［43］。ROS活化的靶点为caspase、磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B通路分子和NF－κB，同时ROS也能介导死亡受体的聚集，并快速活化p38 MAPK通路［44］。目前有文献证实，ROS可直接引起PMN凋亡［44－45］，但ROS参与PMN凋亡的确切信号转导通路目前尚不明确。ROS可能通过直接氧化DNA、修饰蛋白质和酶等途径调节PMN凋亡的过程［46］。过氧化氢是ROS调节生物活性的主要氧化还原介质，也是PMN凋亡机制的中间介质，其氧化产物羟基自由基可能在PMN凋亡中起关键作用［47］。研究发现，过氧化氢的浓度与PMN的凋亡率相关，过氧化氢表达减少可抑制PMN凋亡，同时增加白细胞介素的表达［22，47］。抗氧化剂可通过抑制ROS的累积以及结合NF－κB通路的下游产物，促进PMN凋亡。ROS还与生存信号的转导相关，NF－κB激活可能参与PMN生存信号的转导，提高PMN中过氧化氢含量可导致NF－κB活化，而PMN暴露于过氧化氢中可抑制NF－κB的核易位;此外，ROS的分子类型对PMN凋亡也有一定影响［48］。

3 小 结

恢复PMN正常的凋亡节律可减少PMN与血管内皮细胞的相互作用以及由于存活时间延长而导致的有害酶和炎症因子的释放，减轻OS患者的全身氧化应激和炎症反应，减少心血管合并症的损害。因此，更好地理解PMN凋亡的分子机制对于寻找新的治疗靶点至关重要。阻断或削弱NF－κB、HIF－1通路可促进PMN凋亡、抑制白细胞介素－8等前炎症因子的产生，从而对COPD、OSA以及OS患者产生保护作用。在OS患者中，低氧诱导PMN凋亡的机制可能更复杂，未来需开展更多关于OS患者低氧导致PMN凋亡延迟的相关分子机制的研究，为减少OS患者的心血管损害提供新思路。