HPLC-加校正因子自身对照法测定谷胱甘肽有关物质*

王福坚,黄孟秋,黄子健,陈新阳,蒋 能

(1 广州白云山明兴制药有限公司，广东 广州 510250；2 广州白云山医药集团股份有限公司，广东 广州 510130；3 广西医科大学附属肿瘤医院药学部，广西 南宁 530021)

谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酰，glutathione)，存在于所有动物细胞中，正常环境下以其硫醇还原型(GSH)存在，是细胞内主要的非蛋白质巯基化合物。对GSH的药理学研究结果表明[1-5]，GSH具有神经保护作用，抗惊厥、癫痫发作及镇痛作用，血管保护作用(包括抗高血压作用、抗血栓作用和抗动脉粥样硬化)，抗HIV作用，抗肿瘤和化疗保护作用，听力保护作用，抗炎等。林彤慧等[6]基于《美国药典》中方法，通过调节流动相pH，进行梯度洗脱，开发了一种高效液相色谱法用于测定谷胱甘肽中有关物质。为了更好控制谷胱甘肽的质量，本方法综合各国药典和文献后，开发了一种新的高效液相色谱法用于测定谷胱甘肽中有关物质，该方法高效、准确，能够满足谷胱甘肽中有关物质的测定。谷胱甘肽和杂质的化学结构和名称如图1 所示，后文中出现的杂质以其字母代替。

图1 谷胱甘肽和杂质A、B、C和D结构式Fig.1 Structural formula of glutathione and its impurities A, B, C and D

1 实 验

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；色谱柱C184.6×150 mm，5.0 μm，华谱；FE28型 pH 计，瑞士Mettler Toledo 公司；XPE105 十万分之一天平，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.1.2 试剂

磷酸二氢钾(色谱级)，上海凌峰化学试剂有限公司；庚烷磺酸钠(色谱级)，南京化学试剂有限公司；磷酸(AR)，国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱级)， Merck公司；谷胱甘肽(批号130904)，浙江海正药业股份有限公司；谷胱甘肽对照品(批号140706-200702)，中国药品生物制品检定所；杂质A对照品，批号P140320-MY069435，上海紫域生物科技有限公司；杂质B对照品，批号MKBG4156V，Sigma-aldrich；杂质C对照品(批号L130424)，阿拉丁；杂质D对照品(批号P140320-MY352072)，上海紫域生物科技有限公司。

1.2 实验方法

(1) 流动相配制：称取称磷酸二氢钾6.80 g；庚烷磺酸钠2.02 g，加水1000 mL溶解，用磷酸调节pH至(2.8±0.05)。量取磷酸二氢钾-庚烷磺酸钠溶液970 mL；量取甲醇30 mL；以上两溶液混合，过滤，脱气，即得。

(2)供试品溶液配制：精密称定谷胱甘肽原料约12.5 mg，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中约含0.5 mg的溶液，过滤，作为供试品溶液。

(3) 对照品配制：精密量取供试品溶液2 mL，置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，作为对照溶液。

(4) 样品储备液配制：精密称取杂质A、B、C 及D对照品各约10 mg，分别至4个10 mL 容量瓶中，加流动相溶解后稀释至刻度，摇匀，分别作约为1 mg/mL的方法开发用杂质A、B、C 及D 对照品溶液。

(5)系统适用性溶液：精密称取谷胱甘肽约10 mg，置 10 mL容量瓶中，分别精密移取上述杂质A、B、C 及D 对照品溶液各1 mL 后，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得谷胱甘肽约为1.0 mg/mL，杂质A、B、C 及D 约为100 μg/mL的溶液，过滤，作为系统适用性溶液。

(6)色谱条件：华谱色谱柱C184.6×150 mm，5.0 μm，流动相流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测器为DAD 检测器(二极管阵列检测器) ，检测波长为210 nm，进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

按照“2. 6”条色谱条件，取“2. 5”条系统适用性溶液进样并分析，色谱图见图2，理论塔板数按谷胱甘肽计算不低于6000，主药与杂质及各个杂质之间的分离度均大于2.0。

图2 系统适用性溶液色图谱Fig.2 Chromatograms of System Applicability

2.2 专属性试验

按照“2. 2”供试品溶液的配置浓度，分别按要求配置专属性考察混合对照溶液、酸破坏供试品溶液、碱破坏供试品溶液、氧化破坏供试品溶液、光照破坏供试品溶液、高温破坏供试品溶液，按“2. 6”条色谱条件进行测定。结果表明，谷胱甘肽在经强酸、强碱、热及光照破坏主要产生杂质A、杂质B以及未知杂质；经氧化破坏主要使杂质C增加，也产生未知杂质。各破坏性试验产生的降解产物与主峰在该色谱条件下分离度均符合要求；且主峰峰纯度符合要求，该方法专属性良好。

表1 谷胱甘肽和杂质A、B、C、D的线性回归方程、校下因子、检测限、定量限、Table 1 Standard curves,correction factor, LODs and LOQs of glutathione and its impurities A, B, C, D

2.3 检出限、定量限、校正因子、线性方程和范围

对于谷胱甘肽和已知杂质杂质A、B、C 与D，检测限(LOD)和定量限(LOQ)是根据信噪比法来确定的。将已知浓度的杂质贮备液稀释到低浓度的试样，逐步稀释后按分析方法测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较， 当信噪比 S/N=10 时，为谷胱甘肽、杂质A、B、C 与D 的定量限和当信噪比S/N=3时，为谷胱甘肽、杂质A、B、C 与D 的检测限，结果见表1。在定量限浓度至不低于指标浓度150%的范围内取5个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，具有良好的线性关系r，并确定校下因子f，结果见表1。

2.4 精密度和准确度

2.4.1 精密度

按分析方法项下方法，分别进样6次系统适应性溶液，记录色谱图，杂质A、B、C 与D峰面积的RSD值分别为0.1%、0.1%、0.6%、0.5%。结果表明，方法精密度良好。

2.4.2 准确度

准确度是通过配制杂质A、B、C 与D限度溶液80%，100%，120%三个指标不同浓度样品溶液测得的平均回收率为99.74%、101.22%、101.17%、101.62%。结果表明，该方法测定杂质A、B、C 与D准确度均良好。

2.5 耐用性试验

分别调节流速为0.8、1.0和1.2 mL/min；柱温25 ℃、 30 ℃和 35 ℃；pH 2.6、2.7、2.8、2.9、3.0时进行系统耐用性试验，结果表明，当流速、流动相pH和柱温发生微小变化时，各杂质与主峰间的分离度符合要求；试验表明，该方法耐用性良好。

2.6 稳定性试验

在2 h内，供试品溶液的各杂质峰面积没有明显变化；供试品溶液放置2 h后，产生杂质A，杂质C和未知杂质的含量明显增加，杂质D的含量在供试品溶液放置16小时后明显增加。因此，供试品溶液应临用新配。

2.7 供试品有关物质测定

取本品3 批，按照项下中供试品配制方法，按照分析测试项下方法进行测定，杂质A、B、C、D其他单个最大杂质与总杂质以自身对照法测定，结果见表2。结果显示，3 批还原型谷胱甘肽有关物质检测结果均符合要求。

表2 谷胱甘肽有关物质测定结果Table 2 Test results of the impurities of glutathione (%)

3 结 论

谷胱甘肽及其杂质A、B、C、D均为氨基酸类两性有机物，分子极性较大，C18固定相中的保留较弱，一般要通过特殊的色谱柱和梯度洗脱才能将其有效分离。本方法通过流动相中加入离子对试剂庚烷磺酸钠与谷胱甘肽及其杂质A、B、C、D形成离子对；同时调节流动相pH值抑制其羧基解离，增长保留时间；使用普通C18色谱柱和等度洗脱获得较好的分离度。该方法样品处理便捷、专属性强，灵敏度高，重复性好，测定结果准确，可为谷胱甘肽质量标准的建立提供技术支持。