一测多评法测定舒胆片中5种成分的含量
2021-11-30籍瑞芳孟德新
籍瑞芳 孟德新
1.济南市食品药品检验检测中心中药检验科，山东济南 250102；2.济南市章丘区中医医院门诊中药房，山东济南 250200
舒胆片是由大黄、虎杖、芒硝、栀子等九味药材经煎煮、制粒、颗粒混合而制成的片剂，具有清热化湿、利胆排石，行气止痛的功效[1]。在临床上主要用于急慢性胆囊炎的治疗，联合拉氧头孢钠使用，可显著提升治疗效果[2-4]。舒胆片的质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二十册中[1]，该标准仅对大黄和栀子苷进行了薄层鉴别，未对任何成分进行定量分析，无法准确反映其质量水平。舒胆片中的君药大黄和佐药虎杖含有多种蒽醌类物质，多为蒽醌的羟基、羧甲基、甲氧基和羧基衍生物，是其主要的药效成分[5-9]。本研究采用一测多评法（quantitative analysis of multi-components with a single-marker，QAMS），测定舒胆片中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量，以期全面了解舒胆片中的活性成分，为研究舒胆片的临床药理特性提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-2030 Plus 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；METTLER TOLEDO MS204TS/02（瑞士梅特勒公司）；MS205DU 电子天平（瑞士梅特勒公司）；DK-98-Ⅱ恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.2 对照品与试剂
芦荟大黄素（110795-201308，含量97.8%），大黄酸（110757-201607，含量99.3%），大黄素（110756-201512，含量98.7%），大黄酚（110796-201922，含量99.4%），大黄素甲醚（110758-201616，含量99.0%），均购自中国食品药品检定研究院。
样品：舒胆片（陕西汉王药业有限公司，批号：004001、006001、010003、011003、012003）。
试剂：流动相用甲醇为色谱级（美国TEDIA）；水为实验室自制超纯水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1 毫升含芦荟大黄素9.9365 μg、大黄酸9.5824 μg、大黄素108.2739 μg、大黄酚43.8950 μg 和大黄素甲醚19.1268 μg 的混合溶液，作为对照品储备溶液。再精密量取上述对照品储备溶液5 ml 至10 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取舒胆片样品20 片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3 次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件
色谱柱：Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速为1.0 ml/min；柱温为35℃；检测波长为254 nm；进样量为10 μl。
2.4 方法学考察
2.4.1 系统适用性和专属性试验 取“2.1”项下对照品溶液和“2.2”项下方法制得的供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样，结果见图1。结果显示，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的色谱峰分离度良好，均大于1.5，理论塔板数均大于5000。用二极管阵列检测器，对供试品溶液中5 个成分的色谱峰进行峰纯度检查，均符合要求。
图1 混合对照品溶液和供试品溶液的HPLC 图谱
2.4.2 线性关系考察 精密量取“2.1”项下对照品储备溶液0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 ml 至10 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的对照品溶液。分别按照“2.3”项下色谱条件进样。以对照品浓度为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。结果表明，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚这5 种成分在各自浓度范围内与峰面积的线性关系良好。
表1 5 种成分线性关系的测定结果
2.4.3 精密度考察 取“2.1”项下对照品溶液，按照“2.3”项下色谱条件重复进样6 次。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积的RSD 依次为：0.072%、0.091%、0.021%、0.054%和0.069%。表明仪器精密度良好。
2.4.4 稳定性考察 取舒胆片样品（批号010003），按“2.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件分别于0、4、8、12、18 和24 h 进样。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积的RSD依次为：1.10%、0.99%、1.28%、1.03%和0.75%。表明供试品溶液在24 h 内稳定。
2.4.5 重复性考察 取同一批号舒胆片样品（批号010003），按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样。计算出6 份样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD 依次为1.67%、1.92%、1.90%、1.67%和1.68%。表明该方法重复性良好。
2.4.6 加样回收率实验 取已知含量的舒胆片样品（批号010003）6 份，每份0.25 g，精密称定，分别精密加入“2.1”项下对照品储备溶液10.0 ml，按“2.2”项下方法制成供试品溶液。按照“2.3”项下色谱条件进样。计算出芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均加样回收率依次为95.22%、96.46%、98.29%、97.90%和95.88%。RSD 依次为1.14%、1.12%、0.76%、0.54%和0.71%。表明该方法的准确度良好。
2.5 相对校正因子的确定
2.5.1 相对校正因子的计算 取“2.1”项下对照品溶液，按照“2.3”项下色谱条件，依次进样2、5、10、12、15、20 μl。以大黄素为内参物（s），分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的相对校正因子（用f 表示）。计算公式为f=（ck/Ak）/（cs/As）（ck、cs 为待测成分和内参物的浓度；Ak、As 为待测成分和内参物的峰面积）[10-12]。结果见表2。
表2 4 种成分相对校正因子
2.5.2 相对校正因子耐用性考察 取“2.1”项下对照品溶液，分别使用2 台不同品牌的HPLC 仪和3 种不同品牌的C18色谱柱，按照“2.3”项下色谱条件进样，计算各成分相对校正因子和RSD，结果见表3 所示。不同品牌的HPLC 仪和C18色谱柱所得的相对校正因子的RSD 均小于5.0%，表明各成分相对校正因子的系统耐用性良好。
表3 不同仪器和色谱柱的相对校正因子
2.5.3 待测成分色谱峰的定位 根据“2.5.2”项下所得色谱图，分别计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚与大黄素的相对保留时间（用r 表示），通过相对保留时间即可对样品中的待测成分进行定位确认[13-15]。并且考察相对保留时间在不同HPLC 仪和不同C18色谱柱中的耐用性。结果见表4。不同品牌的HPLC 仪和C18色谱柱对相对保留时间有影响，但RSD 均小于5.0%，表明各成分的相对保留时间耐用性较好，可用于待测成分色谱峰的定位。
表4 不同仪器和色谱柱的相对保留时间
2.6 QAMS 与外标法（external standard method，ESM）含量测定结果的比较
将5 批舒胆片样品，按照“2.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样。分别采用QAMS 法和ESM 法计算样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。结果见表5。结果表明QAMS 法与ESM 法测得各成分的含量无显著差异，提示QAMS 法可用于舒胆片中多成分的质量分析。
表5 ESM 与QAMS 测定舒胆片中5 种成分的含量
3 讨论
3.1 流动相的选择
本研究考察了不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-甲醇-磷酸溶液系统。当有机相比例较低时，各成分保留时间较长，不利于批量分析，甲醇浓度为85%时保留时间适中，分离度良好；0.1%磷酸溶液有助于改善峰形；一定比例的乙腈-甲醇-磷酸溶液也可以实现良好的分离，但是本着简单实用的原则，最终选用甲醇-磷酸溶液（85∶15）。
3.2 供试品溶液的制备方法优化
由于游离型蒽醌常与糖苷类物质结合生成结合蒽醌化合物[16]，所以本研究采用将结合蒽醌化合物酸解后测定游离蒽醌总量的方法。根据文献[17-20]比较了直接加入甲醇-盐酸进行水解和提取的方法，该方法得到的供试品溶液，在色谱分析时，杂质峰较多，干扰主成分分析。最终采用先用甲醇提取然后加入盐酸和三氯甲烷加热回流进行水解，最后再用三氯甲烷萃取的方法。在对本文采用的制备方法进行考察时，对比了超声和加热回流的提取方法，对比了加热回流的时间0.5、1、2 h，结果表明加热回流提取1 h 效果最佳。
本研究所建立的含量测定方法操作简单、准确度高、重复性好，减少了对照品的用量，降低了实验成本，可作为全面分析舒胆片中蒽醌类物质的检测方法。
