饥饿胁迫下剑尾鱼肝脏代谢组学研究

张彦坤，杨兵坤，李航宇，胡林勇，赵新全，徐世晓，孙平*

(1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003；2.中国科学院西北高原生物研究所，西宁810008)

鱼类除了在胚胎时期能够依靠卵黄或者母体提供的营养生存之外，其余各生活阶段都必须从外界环境中获取食物或能量，当无法从外界获取足够的食物时，其生存、生长、繁殖、甚至后代都会受到影响(宋昭彬，何学福，1998)。自然界中因季节变化、洄游、生存环境恶化，甚至在人工养殖中饲料投喂不均匀导致的鱼类短期饥饿现象十分普遍(Hungetal.，1997；Barcellosetal.，2010；Bar，2014)，更是导致幼、稚鱼高死亡率的重要因素之一。因此，鱼类通过组织学、行为和生理生化活动的改变，如激素的分泌、与能量维持相关的基因表达以及酶激活等方式以降低代谢、延长能量储备满足新陈代谢需要的时间应对饥饿胁迫(Parketal.，2012；覃川杰等，2015)。

饥饿胁迫会对鱼类的肠道、肝脏等组织产生诸多不利影响，譬如减少肠道长度(Riosetal.，2004)和细胞数量、肠褶和刷状边界长度，导致肠道肌纤维排列松散、肠道绒毛受损等(Sire & Vernier，1992)；肝脏组织丧失连续性和致密性、肝细胞和细胞核变小，核仁丢失，线粒体增大，胞间层空隙变大，细胞质严重崩溃；降低胃黏膜皱褶高度、黏膜下层厚度、上皮细胞高度及胃腺厚度(付世建等，1999；Huretal.，2006；Zengetal.，2012；Sakyietal.，2020；Fanetal.，2021)。另外，饥饿会引起鱼类生理显著变化，造成肝脏氧化应激，同时肠道中关于超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量发生变化导致组织损伤(Bhattacharyyaetal.，2014；Peteretal.，2020)，为了应对饥饿环境和产生的氧化应激，鱼类细胞会通过自噬产生氨基酸、核苷酸和脂肪酸产物来维持正常的代谢，从而适应饥饿胁迫(Talloczyetal.，2002)。在肠道微生物方面，饥饿会导致鱼类肠道中微生物菌群大量死亡(Kohletal.，2014)，进而影响消化酶的活性(Lietal.，2019)，也会导致免疫屏障受到影响(Alonsoetal.，2019)，这种现象在大西洋鲑Salmosalar(Martinetal.，2010)、草鱼Ctenopharyngodonidellus(Tranetal.，2018)、虹鳟Oncorhynchusmykiss(Soltanian & Gholamhosseini，2019)和杂交石斑Epinephelusfuscoguttatus×E.lanceolatus(Liuetal.，2020)中都存在。

剑尾鱼Xiphophorushelleri是一种小型、强壮、易喂养的卵胎生花鳉科Cyprinodontidae鱼类，具备繁殖世代时间短(1～1.5个月)、雌雄易区分、对环境变化敏感、性情温顺、颜色靓丽、便于在实验室条件下进行纯化培养等特点，已被用作水生实验动物的模式生物，具有广阔的发展前景，近年来养殖规模逐渐扩大(吴淑勤等，2005；Han & Fang，2010)。饥饿胁迫过去已被研究，但是随着组学技术的发展，其对鱼类的影响有待进一步发掘，代谢组学技术可以检测饥饿对鱼类肝脏中小分子代谢物的影响，随后利用生物信息学探讨饥饿对鱼类肝脏的影响。本实验旨在通过代谢组学技术，研究剑尾鱼在面对饥饿胁迫时，肝脏中受影响较大的代谢物与相关的代谢通路，阐明饥饿胁迫对鱼类肝脏代谢物层面的影响，为了解饥饿胁迫对鱼类肝脏代谢组的影响及其小分子代谢物调节机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

实验仪器：Triple TOF 5600+质谱仪(AB SCIEX)，色谱：Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(Agilent)。色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column。

试剂：乙腈(Merck，1499230-935)、乙酸铵(Sigma，70221)、甲醇(Merck，144282)、氨水(Merck，105426)，所有实验试剂均为分析级或HPLC级。

1.2 实验动物

本次实验动物为雄性红剑尾鱼，购于陕西红剑尾鱼养殖基地。选择5月龄、规格相近、体表无伤痕、鳞片完整、体色鲜艳且体质健壮的红剑尾鱼作为实验鱼。在正式实验前，将剑尾鱼进行为期2周的驯化，水温(26±0.5)℃，溶解氧≥5 mg·L-1，24 h曝气，14 h光/10 h暗周期，每天投喂2次(09∶00和 17∶00)，投喂寸金牌商品饲料，每天投喂量为鱼体质量的3%，每3天更换1次水。

1.3 实验设计

2周驯化结束后，将体长和体质量相近的剑尾鱼随机分为对照组和饥饿组，每组24尾，称量初始体质量。每3天换1次水，为避免个体间攻击行为的影响，每条鱼单独饲养，每个养殖单元长10 cm×宽15 cm×高10 cm，水深8 cm(图1)。对照组在实验期间正常喂养，投喂量和投喂时间与驯化期相同，饥饿组在实验期间连续14 d禁食。实验环境水温、光周期等环境与驯化环境相同。14 d后，再次称量实验鱼的体质量，然后使用MS-222鱼用麻醉剂麻醉，在超净工作台内用蒸馏水冲洗鱼体 3次后置于冰上解剖，取肝脏置于液氮中保存，实验结束后，组内随机选取4尾鱼的肝脏样品混合为1个肝脏样本，每组6个肝脏样本。

1.4 代谢物提取与液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析

取肝脏样本在液氮中研磨，每样称取100 mg，加入200 μL预冷水和800 μL预冷的甲醛/乙腈(1∶1，v/v)，混匀，冰浴中超声60 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，16 000 r·min-14 ℃离心20 min，取上清。上清在高速真空浓缩离心机挥发干。质谱检测时加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1，v/v)复溶，14 000 r·min-14 ℃离心15 min，取上清液进样分析。

整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中，样品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)使用HILIC色谱柱进行分离，进样量为5 μL，柱温为25 ℃，流速0.3 mL·min-1；色谱流动相A：水+25 mmol·L-1乙酸铵+25 mmol·L-1氨水，B：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0～0.5 min，95%乙腈；0.5～7 min，乙腈从95%线性变化至65%；7～9 min，乙腈从65%线性变化至40%；9～10 min，乙腈维持在40%；10～11.1 min，乙腈从40%线性变化至95%；11.1～16 min，乙腈维持在95%。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。每例样品分别采用电喷雾电离(ESI)进行正离子和负离子模式检测。样品经UPLC分离后用Triple-TOF 5600质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。

1.5 数据预处理与代谢物识别

原始数据经Abf Converter转换成abf格式，然后采用MSDIAL程序中的XCMS进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<25 ppm)和二级谱图匹配的方式，检索MassBank公共数据库。对提取得到的数据，删除组内缺失值>50%的离子峰，整合正负离子峰并应用SIMCA-P14.1进行模式识别，数据经归一化预处理后，进行多维统计分析，包括无监督主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。

2 结果

2.1 饥饿前后剑尾鱼体质量变化

重复测量方差分析结果表明，实验前后对照组体质量的差异极显著(F1，10=321.448，P<0.001)；实验前后饥饿组体质量的差异极显著(F1，11=490.797，P<0.001)；实验后2组之间的差异极显著(F1，10=843.779，P<0.001)(图2)。

2.2 样本原始数据处理与主成分分析

PCA分析结果显示，对照组与饥饿组在空间中均完全分开，说明在代谢水平上可以发现饥饿对肝脏代谢物的代谢模式产生了影响(图3:a)。对照组与饥饿组之间的OPLS-DA分析结果显示，OPLS-DA的具体模型参数为R2=0.945，Q2=0.735，R2、Q2>0.5表明模型稳定可靠，未发生过拟合现象(图3:b)，表明2组之间的代谢物具有明显差异，可进行下一步分析。实验中所有数据均处于95%置信区间内。

2.3 差异代谢物的筛选

利用LC-MS分析对照组与饥饿组样品在正离子和负离子模式下的代谢物组成，共采集到 13 842个代谢峰，其中正离子模式采集到10 317个，负离子模式采集到3 525个，基于OPLS-DA模型中的VIP值进行差异代谢物的筛选，选取VIP>1的代谢物作为差异的代谢物，共筛选出 5 558种差异代谢物，3 119种上调，2 439种下调，通过单变量分析方法绘制2组肝脏样本间差异代谢物的火山图(图4)，随后选择FC>2或FC<0.5，且P<0.05作为筛选标准选出具有明显差异的代谢物，共筛选出103种代谢物拥有具体的代谢通路，在此基础上构建差异代谢物并进行聚类分析(图5)，结果表明，共有40种代谢物表达上调，63种代谢物表达下调。

2.4 差异代谢物的代谢通路分析

为了确定受到饥饿胁迫干扰的生物途径，使用KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)将饥饿组与对照组比较后得到的显著性差异代谢物进行KEGG代谢通路富集(图6)。挑选10条显著性差异代谢物富集最多的代谢通路制成气泡图，分别是牛磺酸和亚牛磺酸代谢(3种代谢物)、淀粉和蔗糖代谢(6种代谢物)、嘌呤代谢(5种代谢物)、半乳糖代谢(6种代谢物)、FoxO信号通路(2种代谢物)、不饱和脂肪酸的生物合成(5种代谢物)、氨基酸的生物合成(6种代谢物)、氨基酰基-核糖核酸的生物合成(4种代谢物)、氨基糖和核苷酸糖代谢(6种代谢物)和ABC转运蛋白(13种代谢物)。

2.5 显著性差异代谢物与代谢通路

根据参与富集排名前10的代谢通路的代谢物筛选出8种代谢物：D-甘露糖、α-D-半乳糖、蔗糖、亚油酸、L-精氨酸、D-葡萄糖、牛磺酸和脱氧肌苷，分别参与8条代谢通路(表1)。

表1 饥饿后剑尾鱼肝脏中的显著性差异代谢物

2.6 代谢通路分析

在筛选出具体的显著性差异代谢物之后，通过KEGG网站代谢通路中物质的变化来寻找代谢通路间的关系，可以看出饥饿后的剑尾鱼肝脏半乳糖代谢中半乳糖表达下调后影响了氨基糖和核苷酸糖代谢中的α-D-半乳糖，进而导致UDP-D-葡萄糖表达的下调影响到淀粉和蔗糖代谢(图7)。

3 讨论

本实验选择剑尾鱼作为实验动物，通过代谢组学技术研究饥饿对其肝脏代谢的影响。因为可以识别特定代谢通路的紊乱与否，代谢组学方法比传统参数(如鱼类健康的生理参数或生化标记)更敏感，反应比传统生物标记更具生物学意义(Longetal.，2020)。从筛选出的重要差异代谢物和KEGG通路富集分析的结果看，饥饿胁迫影响了剑尾鱼肝脏中的FoxO通路、糖代谢、脂肪代谢和氨基酸代谢。

剑尾鱼遭受饥饿胁迫后，肝脏中糖类物质如D-甘露糖、α-D-半乳糖、D-葡萄糖以及蔗糖显著下调，这个结果与其他学者的结果相同(Jiaoetal.，2020)。此外，在通路富集结果中发现饥饿影响了FoxO信号通路，FoxO信号通路与多种生物学过程有关，包括细胞代谢(Halletal.，2000)、免疫和抗氧化应激(van Der Heideetal.，2004；Balabanetal.，2005)。在饥饿胁迫下，FoxO对促进糖异生酶的表达具有关键作用，同时参与促进碳水化合物向脂肪酸的转变，据此推测持续14 d的饥饿过程中，剑尾鱼依靠肝脏中糖异生提供能量。在氧化应激方面FoxO信号通路可以驱动参与对抗氧化应激的基因的表达，从而保护细胞功能(Grossetal.，2008)，Gao等(2019)在对斑点叉尾Ictaluruspunctatus的研究表明，FoxO在对细菌感染的免疫应答中发挥重要作用。肝脏内环境的稳态涉及多种物质和细胞共同调节，糖类代谢物D-甘露糖作为免疫蛋白的合成物质之一，对生物体的健康和免疫功能具有重要的意义(van Immerseeletal.，2002；Berge & Wierup，2012；Jenne & Kubes，2013)。饥饿胁迫导致剑尾鱼肝脏中的D-甘露糖表达极显著下调，可能会导致机体对环境中其他的胁迫如炎症、受伤、免疫以及对不良病菌的适应性和抵抗性降低，其中肝脏炎症和免疫被视为一个高度复杂的动态反应网络，营养代谢物的变化会影响适应性免疫(Humphrey & Klasing，2004；Robinsonetal.，2016)。有研究表明，在面对环境胁迫导致的免疫力降低时，鱼类会增加自身的免疫物质来应对环境胁迫，如鲫鱼Carassiusauratus在面对重金属锰污染时，会增加体内的皮质醇来增加自身的适应性(Alikoetal.，2018)，类似的情况在大西洋鲑Salmosalar中也有出现(Fastetal.，2008)。本实验发现，饥饿后的剑尾鱼肝脏中亚油酸的表达显著上调。推测可能是饥饿胁迫发生后，鱼体肝脏细胞通过自噬来获取营养，而亚油酸是组成细胞膜磷脂的重要成分(马宏峰，2007)，膜的分解最终导致了亚油酸表达上调。饥饿后亚油酸在肝脏中的显著上调是为了弥补与免疫相关的糖类物质的显著下调，维持机体的正常免疫与抗炎症系统，但饥饿胁迫后鱼类的免疫能力是否下降仍需要进一步验证。

饥饿胁迫后，剑尾鱼肝脏中的L-精氨酸和牛磺酸表达显著下调。精氨酸作为鱼类机体细胞内功能最多的必需氨基酸之一，其代谢产物在动物机体能量与脂肪代谢具有重要作用，同时精氨酸可在鱼体内生成NO，参与鱼类免疫功能调节(万军利等，2006；韩凤禄等，2016；王莹等，2017)。牛磺酸是鱼类生长发育必不可少的物质(石立冬等，2020)，具有增强免疫力和抗氧化能力(田芊芊等，2016)。剑尾鱼肝脏中精氨酸和牛磺酸显著下调，可能是经过14 d饥饿胁迫并消耗大量糖类和脂肪之后开始消耗氨基酸进行供能，这些氨基酸代谢物的下调和与免疫相关的糖类下调均会影响鱼类的免疫和抗氧化能力，但是亚油酸的上调说明鱼类的免疫调节系统并未因为饥饿胁迫完全丧失。营养和免疫之间的作用是多种多样的，无法获得营养会损害肝脏的保护性免疫(Humphrey & Klasing，2004)，因此，推测饥饿胁迫会损害剑尾鱼肝脏的免疫功能。但仍需要进一步通过免疫学实验观察肝脏内相关的免疫因子或免疫细胞的变化来验证饥饿胁迫对鱼类的免疫影响。

本实验采用LC-MS技术对饥饿胁迫后的剑尾鱼肝脏代谢物进行研究，对提取的差异代谢物经过KEGG网站分析代谢通路得出，饥饿胁迫主要对剑尾鱼肝脏的糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢与FoxO信号通路造成影响，在这些代谢通路中，共筛选出8种具有显著差异的重要代谢物：D-甘露糖、α-D-半乳糖、蔗糖、亚油酸、L-精氨酸、D-葡萄糖、牛磺酸和脱氧肌苷。这些差异代谢物的生理功能显示，饥饿胁迫会对鱼类的免疫、抗炎症以及受伤后机体的修复能力产生影响。