灯盏蜜橘愈伤组织的诱导研究

田 萍

(文山学院三七医药学院，云南 文山 663099)

柑橘类果树为芸香科柑橘亚科柑橘属植物，为柑橘属多年生常绿小乔木，果实红色或桔色，肉质酸甜，含有多种维生素和丰富的碳水化合物[1]。目前，世界上约有140个国家进行商品化柑橘生产，是国际上所有水果中贸易值排在首位的水果[2]。灯盏蜜橘为文山州西畴县特有的地方优质柑橘栽培种，原产西畴县法斗乡灯盏窝自然村，是从20世纪70年代至今在特定的自然条件下，经自然和人为选育而成。20世纪就已经成为文山州较为有名的特色农产品，西畴县曾多次将其列入发展规划项目。但因为杂交品种的迁入，以及其种植和管理的粗放，使其产生了较明显的品种退化。如，易感染病虫害、抗逆性差、产量下降、经济价值降低等。灯盏蜜橘富含多种维生素，含糖量高，具有果型美观，皮薄多汁，酸甜适中，口味纯正的优点，其市场价格较高，具有很高的经济价值[3]。

灯盏蜜橘主要分布于云南省西畴县，属于文山州特色品种，至今该品种仍未被命名，国内外几乎没有相关研究报道。灯盏蜜橘的组织培养，对当地蜜橘种植规模、保持品种纯度、缩短育种年限等方面具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料灯盏蜜橘植株、实生苗采自西畴县法斗乡石蛾村民委灯盏窝自然村。

1.2 实验方法

1.2.1 不同外植体对诱导愈伤组织的影响

从同一苗龄的植株上选取不同外植体，根尖、带腋芽的茎段、新发幼嫩的芽、叶片接种于诱导愈伤的培养基上，培养基配方为6-BA 2.0mg·L-1加NAA 1.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加琼脂7.8g·L-1加活性炭0.1g·L-1。有研究显示，进行木本植物组织培养时，在培养基中加入少量活性炭，能有效减轻褐化发生率。本实验中，活性炭的浓度为0.1g·L-1[4]。外植体接种后，在24±2℃，光照1800～2000lx，照明12h·d-1条件下培养，每隔5d观察1次，记录污染数、愈伤组织的诱导情况、产生愈伤组织的时间等，20d后统计愈伤组织诱导率，公式：

愈伤组织诱导率=愈伤组织数/外植体数×100%

1.2.2 不同6-BA和NAA激素组合对灯盏蜜橘带腋芽的茎段诱导愈伤组织的影响

选取灯盏蜜橘带腋芽的茎段，接种于蔗糖30g·L-1、琼脂7.8g·L-1、活性炭0.1g·L-1，添加不同浓度的6-BA和NAA的愈伤组织诱导培养基中，具体见表1。9个处理分别接种30段，重复3次，20d后统计愈伤组织诱导率。

表1 6-BA和NAA的浓度组合

1.2.3 不同暗处理时间对灯盏蜜橘带腋芽的茎段诱导愈伤组织的影响

选取灯盏蜜橘带腋芽的茎段，接种于诱导愈伤的培养基上，培养基配方为6-BA 3.0mg·L-1加NAA 1.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加琼脂7.8g·L-1加活性炭0.1g·L-1。培养温度24±2℃，设置暗处理时间梯度为0d、3d、5d、7d、9d、14d，每个处理接种30段，重复3次，30d后统计愈伤组织数及形成愈伤组织的时间，计算愈伤组织诱导率，并对比形成的愈伤组织的特性。

2 实验结果与分析

2.1 不同外植体对灯盏蜜橘诱导形成愈伤组织的影响

不同的外植体(A根尖、B带腋芽的茎段、C叶片、D新发幼嫩的芽)对灯盏蜜橘诱导愈伤组织的影响存在差异，情况如表2。

表2 灯盏蜜橘不同外植体形成愈伤组织的情况

由表2可知，带腋芽的茎段，出现愈伤的时间最早，诱导率最高，达到68.67%，且产生的愈伤组织蓬松，能诱导出芽。新发幼嫩的芽其次，诱导率为38.64%。叶片在前15d内无明显变化，在17d左右，叶片边缘出现非胚性组织，根尖在愈伤诱导的过程中，始终无明显的变化。

综合形成愈伤组织的情况，在灯盏蜜橘的愈伤组织诱导过程中，带腋芽的茎段较适宜做外植体，新发幼嫩的芽其次，而叶片与根尖不适宜。

2.2 不同6-BA和NAA激素组合对灯盏蜜橘带腋芽的茎段诱导愈伤组织的影响

由表3可知，带腋芽的茎段在相同培养条件下培养30d后，处理2与处理3愈伤组织诱导率都达到了80%以上，处理2愈伤组织诱导率达90.33%。经显著性分析，处理2与处理3差异不显著。结果表明，6-BA和NAA的不同浓度组合一定程度上能够影响灯盏蜜橘带腋芽的茎段诱导愈伤组织的诱导率。6-BA 3.0mg·L-1加NAA 1.0mg·L-1组合，愈伤组织诱导率最高，且愈伤组织出现较多芽眼，可以缩短再分化形成不定芽的时间。当NAA的浓度>0.2mg·L-1时，愈伤组织开始出现玻璃化。

表3 不同激素水平对灯盏蜜橘愈伤组织诱导的影响

2.3 不同暗处理时间对灯盏蜜橘带腋芽的茎段诱导愈伤组织的影响

有研究显示，适当的暗处理更有利于愈伤组织的分化[6]，本实验进行了暗处理比较分析，结果见图1、表4。由图1可以看出，未进行暗处理的外植体，形成的愈伤组织玻璃化较明显。经过暗处理的外植体，形成的愈伤组织玻璃化现象不明显。

图1 暗处理对灯盏蜜橘愈伤组织的影响

不同暗处理时间对灯盏蜜橘诱导愈伤组织的影响不同。诱导愈伤组织培养30d后，愈伤组织诱导率随着暗处理时间的增加而降低。结果见表4，随着暗处理时间的增加，愈伤数开始减少。结果表明，适当的暗处理虽然可以减少玻璃化现象发生，但愈伤组织诱导率会有所减少，暗处理一定程度上抑制了灯盏蜜橘带腋芽的茎段愈伤组织的形成。

表4 暗处理时间对灯盏蜜橘诱导愈伤组织的影响

3 结论与讨论

本文对灯盏蜜橘进行了愈伤组织的诱导研究，结果表明，带腋芽的茎段较适合做外植体，这与王小敏等[7]在两面针的组织培养与快速繁殖中结果相似,可能与带腋芽茎段的分化能力较强有关。此外，有一些学者还利用胚轴为外植体进行实验[8]，诱导率也较高。在培养基选择方面，本实验选用的是MS培养基为基本培养基，添加激素为6-BA与NAA，最佳组合为(6-BA 3.0mg·L-1加NAA 1.0mg·L-1)。也有学者在柑橘的愈伤组织诱导实验中采用MT培养基[8]，添加激素用6-BA与GA3。后续的研究中也可以尝试用这2种培养基做对比实验。本实验还探讨了暗处理时间对愈伤组织诱导的影响，结果表明，暗处理一定程度上对灯盏蜜橘带腋芽的茎段形成愈伤组织产生了抑制，诱导愈伤组织需在一定光照下进行。

在本实验中，仅探讨了灯盏蜜橘愈伤组织诱导的一些问题，未探讨增殖与生根方面的内容，为保护好本土柑橘的资源，需完善灯盏蜜橘的组织培养技术，还有待学者进行研究。