毛菊苣中母菊素的体外抗肝纤维化作用*

努力比亚·阿不都克尤木，秦冬梅，胡利萍，侯金秋，鲁晓擘

(1.新疆医科大学第一附属医院感染科，乌鲁木齐 830054；2.石河子大学药学院，石河子 832002)

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是一种继发于多种原因引起的急慢性肝损伤后的一种自我损伤修复反应[1]，引起HF的因素有许多，其中肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活跃、转化和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)长期大量沉积都是形成HF的主要因素[2-3]。而转化生长因子-β1(tansforming growth facter beta 1，TGF-β1)是启动和促进HSC向肌成纤维细胞转化的关键促纤因子[4-7]，主要以自分泌和旁分泌两种形式促进HSC活化，并生成大量ECM，从而导致肝纤维化[8-9]。研究表明，在肝纤维化发展过程中常伴随着TGF-β1/Smad家族胞浆蛋白表达的失调，梁冰洁等[10]研究发现在抗肝纤维化过程中，TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1、Smad2、Smad4 以及Smad7 mRNA发挥重要作用。因此TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1、Smad2、Smad3和负反馈调节信号分子Smad7在肝纤维化中发挥主要作用[11-12]。

菊苣系菊科植物毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)或菊苣(CichoriumintybusL.)的干燥地上部分或根[13]，毛菊苣作为菊科菊苣属植物，具有良好的药理活性以及药用价值。本课题组前期研究表明毛菊苣根粗提物中有效成分具有良好的抗肝纤维化作用[14]，但对于毛菊苣根部得到的倍半萜内酯类化合物192号的抗肝纤维化作用机制研究笔者未见报道。本文通过192号对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用及作用机制研究，进而探讨毛菊苣抗肝纤维化的物质基础，以期获得抗肝纤维化先导化合物。

1 试剂与仪器

1.1仪器 电子天平(德国Sartorius，感量：0.01 mg，型号：BP211D)；优普特实验超纯水机(成都超纯科技有限公司，型号：UPT-11-10T)；高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司，型号：Sorvall Legend Micro 17R)；倒置显微镜(日本Nikon公司，型号：T2R)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司，型号：TDE40086FA)；PCR荧光定量仪(美国罗氏，型号：LightCycler 480)；凝胶成像系统(美国UVP公司，型号：EC3600)；CO2孵育箱(美国Thermo Fisher公司)；梯度基因扩增仪[北京大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，型号：TC1000-G]；快速混匀器(国华电器，型号：SK-1)；生物安全柜(德国Heraeus，型号：Hearsafe)。

1.2药品与试剂 大鼠肝星状细胞HSC-T6(中南大学湘雅医学院提供)；192号化合物为实验室自制；胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司，批号：1828728)；DMEM Basic培养基(Gibco公司，批号：8119445)；HIFIScript cDNA Synthesis Kit(康为世纪，批号：30441)；琼脂糖(Biowest Agarose公司，AGARose G-10)；QPCR引物(生工生物公司)；CR Master Mix(Thermo scientific)；TGF-β1(Bioworld Technology公司，批号：1218209)；MTT(Sigma公司)；EvaGreen染料(Biotium公司，批号：31000)；M-MLV第一链合成试剂盒(invitrogen公司，批号：C20012500BT)；PBS PH7.2Basix(10x)(批号：20140310)、胰酶(批号：20200824)、青霉素-链霉素双抗(10 000 U)(均购自Solarbio公司)；Taq酶(批号：J20728)、DEPC(批号：04207)、TRNZOL Universal Reagent试剂(批号：P4621)、核酸染料、6xDNALoading Buffer(均购自天根公司)；二甲亚砜(DMSO)、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(均购自天津市富宇精细化工有限公司)。

2 方法与结果

2.1方法

2.1.1供试品的制备 将毛菊苣根10 kg，切断成长度1～1.5 cm，用95%乙醇回流提取，浓缩得到提取物浸膏1.28 kg，然后使用正丁醇萃取，将萃取部位上AB-8大孔吸附树脂，先用水洗脱，再依次用30%，60%与90%乙醇洗脱，洗脱液浓缩后，再用十八烷基硅烷键合硅胶填料(octadecyl silane bonded silicagel，ODS)为填料，不同比例的甲醇溶液为流动相进行洗脱；所得馏分再用Sephadex LH-20为填料进行分离，即获得倍半萜内酯类成分192号单体化合物。

2.1.2供试品的测定 毛菊苣中提取得到的母菊素(化学名：8-去乙酰母菊素-8-O-硫酸盐，192号)化合物经测定，其结构式见图1，该化合物首次从毛菊苣中分离得到。

2.1.3192号化合物对HSC-T6增殖作用影响[15]取对数生长期的HSC-T6，以1×105个细胞接种于96孔培养板中，培养24 h后弃去培养基，加入浓度为5，10，20，40，80 μmol·L-1的192号化合物处理细胞，每个浓度设置3个复孔，同时设对照组，继续培养24 h后加入MTT溶液每孔20 μL，孵育4 h，弃培养基，加入DMSO裂解细胞，用酶标仪在波长450 nm处测吸光度A值，按公式计算细胞生长抑制率(R)。存活率=(药物组A值/对照组A值)×100%；抑制率=[1-(药物组A值/对照组A值)]×100%。

2.1.4RT-PCR法检测各组mRNA表达的影响[16]

①提取RNA。将HSC-T6细胞以1×105个·mL-1接种在6孔板内孵育24 h后弃去培养液，正常对照组加入含10%胎牛血清的DMEM培养液共同培养24 h及48 h，模型对照组和给药组加入终浓度为5 ng·mL-1TGF-β1的培养液共同培养24 h/48 h，另外给药组分别加入终浓度为10，20，40 μmol·L-1的192号化合物共同培养24 h/48 h，收集各时间点的细胞，按照TRIZOL法提取细胞总RNA。

城市地下综合管廊，即在城市地下建造一个隧道空间，将电力、通信、燃气、供热、给排水等各种工程管线集于一体，实施统一规划、统一设计、统一建设和管理，不仅有效利用了道路下的空间，节约了城市用地，还极大方便了各种市政设施的维护和检修。将城市地下综合管廊建设成三维地理信息模型数据，有利于管理者进行高效的管理和做出应急处理决策等。

②RT-PCR引物设计。根据目的基因序列设计引物见表1。

表1 特异性扩增引物

③RT-PCR。按照反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，反应程序为42 ℃，40 min；85 ℃，5 min；4 ℃，10 min后放置于-80 ℃保存，取出cDNA按Real Time PCR说明进行反应。反应程序为：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；59 ℃，10 s；72 ℃，8 s，扩增45个循环，做溶解曲线又分3步：95 ℃，0 s；65 ℃，15 s；95 ℃，0 s继续，40 ℃，30 s。

④荧光定量PCR结果计算。本研究采用的定量数据分析方法是2-△△CT法[17]。根据所测得CP值，求出待测基因平均CP值相对于GAPDH基因平均CP值的差值，进行归一化，即用目的基因平均CP值减去管家基因平均CP值得到差值，然后对△CT进行归一化，△△CT=△CT(靶基因)-△CT(共用靶基因对照)，再用2-△△CT求出相对同一对照的表达差异。

2.1.5Western blotting检测蛋白表达水平 将HSC-T6细胞以1×105个·mL-1接种在6孔板内孵育24 h后弃去培养液，正常对照组加入含10%胎牛血清的DMEM培养液共同培养24 h，模型对照组和给药组加入终浓度为5 ng·mL-1TGF-β1的培养液共同培养24 h，另外给药组分别加入终浓度为10，20，40 μmol·L-1剂量的192号化合物共同培养24 h后，用BCA进行蛋白定量，加上样缓冲液，沸水煮沸15 min用于Western blotting蛋白检测。根据1：1000(TGF-β1)、1：1000(smad3)、1：1000(smad7)、1：2000(β-actin)、1：5000(二抗)的稀释比例进行孵育。检测TGF-β1、Smad3和Smad7的蛋白表达，验证其过表达及干扰效果。

2.2结果

2.2.1192号化合物对HSC-T6 细胞增殖的影响 MTT法测定细胞增殖，结果显示192号化合物可显著抑制HSC-T6的增殖，在浓度为20 μmol·L-1时对HSC-T6的抑制率为46.97%，随着药物浓度增大反而抑制率下降，说明该药物浓度在20 μmol·L-1对HSC-T6增殖的抑制作用较强，结果见图2。

图2 192号化合物对HSC-T6增殖的抑制作用

细胞给药48 h后HSC-T6细胞mRNA表达的变化与模型组比较，192号化合物中、高浓度组显著下调Smad3 的mRNA表达，对于Smad2、Smad7以及TGF-β1mRNA的表达作用效果不明显，细胞给药48 h mRNA表达结果见图4。

RT-PCR实验表明，192号化合物在TGF-β1刺激HSC-T6细胞24/48 h后均能显著下调大鼠肝星状细胞中TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA表达水平，上调Smad7 mRNA表达水平，实验考察了TGF-β1分别刺激HSC-T6细胞24/48 h，结果显示TGF-β1刺激HSC-T6细胞24 h的作用效果显著，明显优于TGF-β1刺激HSC-T6细胞48 h的效果，由此表明192号化合物在TGF-β1刺激HSC-T6细胞24 h时能发挥最佳效果。

1.正常对照组；2.模型对照组；3.10 μmol·L-1药物组；4.20 μmol·L-1药物组；5.40 μmol·L-1药物组；①与正常对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.05；③与模型对照组比较，P<0.01。

2.2.3192号化合物对HSC-T6 细胞中TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白水平影响 Western blotting结果显示，与空白组比较，模型组细胞的TGF-β1，Smad3的蛋白水平显著升高而Smad 7的蛋白水平明显降低，与模型组比较，192号化合物不同浓度组的TGF-β1和Smad3的蛋白水平表达均降低而Smad 7的蛋白水平升高，192号化合物的中剂量20 μmol·L-1和高剂量40 μmol·L-1使活化后的HSC-T6细胞的TGF-β1和Smad3的蛋白水平表达显著降低，同时192号化合物能够明显上调Smad7的蛋白表达，结果表明192号化合物参与发挥抗肝纤维化是通过下调TGF-β1/Smad通路中TGF-β1和Smad3的蛋白表达以及上调Smad7的蛋白表达，结果见图5。

3 讨论

肝纤维化与HSC的活化和增殖密切相关，HSC通过抑制胶原酶活性使ECM 的降解减少，ECM大量堆积从而形成肝纤维化。尽管肝脏病变的发病机制各不相同，但肝纤维化生成最终共同途径却都与HSC活化相关，因此抑制HSC的活化是治疗肝纤维化的一个重要途径[18]。

1.正常对照组；2.模型对照组；3.10 μmol·L-1药物组；4.20 μmol·L-1药物组；5.40 μmol·L-1药物组；①与正常对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.05；③与模型对照组比较，P<0.01。

毛菊苣作为一种传统的中药材被用于治疗多种疾病，其具有较好的生物活性以及药用价值，其中保肝作用较为明显，有研究表明，毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化具有较好保护作用[19]。本研究首次对毛菊苣中提取出192号化合物倍半萜内酯类化合物进行药效考察，并发现其能显著的抑制由TGF-β1刺激的HSC-T6细胞活化，而HSC-T6细胞活化在肝纤维化进程中发挥着关键性作用。同时大量研究表明[20]，在肝纤维化发展过程中常伴随着TGF-β1/Smad家族胞浆蛋白表达的失调，笔者发现192号化合物在TGF-β1刺激HSC-T6细胞24 h后对TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA表达作用显著，并且192号化合物能够明显抑制TGF-β1和Smad3通路蛋白的表达以及上调Smad7蛋白表达水平，从而抑制由肝纤维化引起的TGF-β1/Smad家族胞浆蛋白表达的异常调控。

综上所述，192号化合物抗肝纤维化作用机制之一是抑制肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路，通过抑制HSC-T6的激活、增殖以及ECM的合成，从而发挥抗纤维化作用。本研究为母菊素抗肝纤维化作用机制奠定实验基础。

①正常对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.05；③与模型对照组比较，P<0.01。