天麻素与薯蓣皂苷元最佳配伍比例筛选及对HUVECs缺氧/复氧损伤的保护机制*

张明烁，叶田园，祝娜，黄秀兰，李志勇

(1.中央民族大学药学院，北京 100081；2 山东中医药大学实验中心，济南 250355)

土家族用天麻配伍延龄草防治“脑衰”病，本课题组前期实验证明，天麻配伍延龄草可以增强双侧颈总动脉结扎所致的痴呆大鼠的学习记忆能力，促进神经递质合成、保护脑细胞[1-2]。天麻素(gastrodin，Gas)是中药天麻的主要活性成分，在抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善缺血缺氧造成的脑损伤、保护神经元等方面具有良好的活性[3-4]。薯蓣皂苷元(diosgenin，Dio)是中药延龄草的主要活性成分，具有保护血管、保护神经、抗炎、抗氧化应激等多种药理作用[5]。有效组分配伍是近年来出现的配伍研究新模式，从复方中各层次(部位-组分-成分)药效物质出发，具有作用明确、靶位清楚、对病证针对性更强等优点[6]。本研究通过基线等比增减设计确定Gas和Dio的配伍比例，并利用主成分分析方法在谷氨酸损伤的SH-SY5Y细胞模型和缺氧HUVECs上优选出最佳配伍比例，并在分子水平研究最佳配伍比例对缺氧HUVECs中HIF-1α、VEGF、iNOS、eNOS蛋白表达的影响，初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1受试细胞 SH-SY5Y细胞由中国中医科学院医学实验中心惠赠。原代HUVECs购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.2药物与试剂 天麻素标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110807-201407)、薯蓣皂苷元标准品(中国食品药品检定研究院，批号：111539-200001)；谷氨酸(北京拜耳迪生物技术公司分装)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1063)；内皮细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)(Science cell，批号：1001)；活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：S0033)；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(Angent，Ab46154)；低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(Abcam，批号：Ab2185)；诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(Abcam，批号：Ab15323)；内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)(Immunoway，批号：YM3164)；山羊抗兔IgG(H+L)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(天德悦生物科技有限公司)；山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP(天德悦生物科技有限公司)。

1.3主要仪器 全自动流式细胞分析仪(美国Beckman Coulter，FC500)；倒置荧光显微镜(Olympus，IX-81)；三气培养箱(Thermo，Hera cell 150)；低温冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司，L535R-1)；多功能酶标仪(美国 Molecular Devices 公司，FlexStation3)；垂直板电泳槽(北京六一生物科技有限公司，DYCZ-24DN)；半干式转移电泳槽(美国 Bio-Rad 公司，Trans-Blot SD)；电泳仪(美国Bio-Rad公司，PowerPac)；脱色摇床(美国Labnet公司，2030-RC-220)。

1.4方法

1.4.1基线等比增减法确定组分配比 依据天麻与延龄草的临床配比(2：1)，结合天麻质控研究中的Gas含量(≥0.20%)[7]、延龄草质控研究中Dio含量(≥1.3 mg·g-1)[8]。临床用药中天麻为主药，因此在配比设计时，除去一侧终点单纯为天麻素，其余配伍比例应保证天麻素的比例>1/2[9]。在此基础上进行基线等比增减设计，得出7组配伍比例为Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，0：10。

1.4.2不同组分配伍比例对谷氨酸损伤SH-SY5Y细胞的影响 ①细胞增殖毒性(cell counting kit-8，CCK-8)法检测SH-SY5Y细胞存活率 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以每孔2×104个接种于96孔板，每孔加200 μL含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12的完全培养基于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培养箱中培养，培养12 h后，更换为无血清的DMEM/F12的培养基，每组6孔，正常对照组给予Locke’s buffer，模型对照组给予2 mmol·L-1谷氨酸(glutamate，Glu)，给药组给予不同比例的Gas和Dio。药物与细胞共培养12 h后，更换为含10% CCK-8的DMEM培养液，37 ℃孵育3 h，使用多功能微孔板检测仪，于450 nm处测定吸光度(A值)。

②Annexin V /PI双染法流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以每孔6×105个接种于6孔板，细胞分组及培养操作同“1.4.2 ①”项，于37 ℃细胞培养箱中培养12 h后，按Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行流式细胞仪检测。

1.4.3不同组分配伍比例对缺氧HUVECs的影响 ①HUVECs的分离、培养及鉴定 参照文献[10-11]的方法，对原代HUVECs进行体外分离、培养及鉴定，并加以改进。以10 mL ECM培养液重悬，制成单细胞悬液，接种于用2%明胶包被的细胞培养瓶内，于37 ℃、5% CO2培养箱培养。72 h后观察细胞形态，每2～3天换液1次，第2—第5代生长状态良好的HUVECs用于实验。用免疫荧光鉴定血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原以鉴定细胞。

②不同组分配伍比例对缺氧HUVECs存活率的影响 取对数生长期HUVECs，以每孔1×104个接种于96孔板，其余细胞培养及分组操作同“1.4.2 ①”项。正常对照组在CO2培养箱中培养，缺氧模型组和药物干预组于三气培养箱(1% O2、5% CO2、94% N2)共培养，药物与细胞共培养12 h后，更换为含10% CCK-8的DMEM/F12培养液，37 ℃孵育3 h，使用多功能微孔板检测仪，于450 nm处测定吸光度(A值)。实验重复3次。

③不同组分配伍比例对缺氧HUVECs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的影响 将细胞以每孔6×105个接种于6孔板，其余细胞分组及培养操作同“1.4.2②”项下，用全自动流式细胞分析仪检测细胞ROS含量。具体实验操作参考ROS检测试剂盒说明书。

1.4.4主成分分析法筛选最佳配伍比例 分别以“1.4.2”和“1.4.3”项下细胞存活率及凋亡率的结果分析SH-SY5Y主成分及HUVECs主成分。首先进行适用性检验，判断能否进行主成分分析；确定主成分数目，当主成分累计贡献率≥70%时，保留相应成分，得出不同配伍组得分顺序。

1.4.5最佳配伍比例对缺氧HUVECs保护作用的机制研究 ①最佳配伍比例对缺氧HUVECs凋亡的保护作用 取对数生长期的HUVECs，以每孔3×105个接种于6孔板，细胞分组及培养操作同“1.4.2②”项下，按Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行操作：取重悬的细胞离心(1000 r·min-1，5 min)，弃上清液，加入Annexin V-FITC 195μL结合液重悬细胞。加入Annexin V-FITC 5μL，混匀。加入碘化丙啶染色液10 μL，混匀。室温避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中，进行流式细胞仪检测，生成散点图，记录数据。

②最佳配伍比例对缺氧HUVECs蛋白表达的影响 取对数生长期HUVECs，接种于25 cm2培养瓶，细胞培养操作同“1.4.3②”项下，正常对照组于CO2培养箱中培养，缺氧模型对照组和给药组(Gas：Dio=8：2)于三气培养箱中共培养12 h。收集细胞，以细胞数量1×107加入1 mL裂解液，重悬细胞，冰上裂解20 min，13 000 r·min-1离心20 min(r=7 cm)，收集上清液，即HUVECs全蛋白样品，用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量，以RIPA裂解液调整蛋白浓度，以SDS-PAGE凝胶电泳分离。湿转法转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，含3%牛血清白蛋白TBST缓冲液(BSA-TBST)封闭，水平摇床孵育30 min。含3%牛血清蛋白的TBST缓冲液(3% BSA-TBST)稀释一抗，iNOS(1：1000)，VEGF(1：2000)，β-actin(1：10 000)，4 ℃水平摇床孵育过夜。5% 脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1：10 000，室温孵育40 min。ECL化学发光法显示结果，胶片曝光，显影2 min，定影。图片扫描后，用Gel Image ststem ver.4.00(tanon，China)软件对图像进行分析。

2 结果

2.1不同组分配伍比例对谷氨酸损伤SH-SY5Y细胞的影响

2.1.1SH-SY5Y细胞存活率 2 mmol·L-1谷氨酸可以使SH-SY5Y细胞的存活率降到63%。当Gas±Dio=10±0，即Gas的浓度为20 μmol·L-1时，可以明显提高细胞的存活率(P<0.05)，随着Dio比例升高，存活率随之下降。见表1。

表1 不同组分配伍比例对谷氨酸损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响

2.1.2SH-SY5Y细胞凋亡 与正常组比较，模型组的正常细胞显著下降，早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞显著增加；与模型组比较，当Gas与Dio的比例分别为6：4，5：5，0：10时，正常细胞的比例均明显提高，晚期凋亡和坏死的细胞显著下降(P<0.05)，并且随着Dio比例的增多，这种下降更为明显。见表2。

2.2不同组分配伍比例对缺氧HUVECs的影响

2.2.1HUVECs 形态学观察与免疫荧光法 细胞鉴定倒置显微镜下观察显示：6 h 后细胞开始贴壁，并逐渐伸展，呈单层的扁平三角形或者多角形；贴壁48 h后，细胞迅速生长、融合，多数细胞聚集成团，形成内皮细胞岛，逐渐向外扩散。贴壁5 d后，细胞融合成片，嵌入排列，融合成典型的铺路石状。

表2 不同组分配伍比例对Glu损伤SH-SY5Y细胞凋亡的影响

免疫荧光法鉴定血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原，结果显示未标记Ⅷ因子一抗的阴性对照组的细胞浆不显示荧光(图1A)，标记了Ⅷ因子一抗的HUVECs的细胞浆呈明亮的绿色荧光，细胞核阴染(图1B)。

A.未标记Ⅷ因子；B.标记了Ⅷ因子。

2.2.2不同组分配伍比例对缺氧HUVECs存活率的影响 如表3所示，在Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3时，可以明显提高缺氧损伤的HUVECs的存活率(P<0.05)。

2.2.3不同组分配伍组对缺氧HUVECs中活性氧(ROS)含量的影响 缺氧12 h后可刺激HUVECs产生大量ROS，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。给药组的7种比例均可显著减少缺氧细胞中ROS含量(P<0.01)。见表4。

2.3主成分分析结果

2.3.1用谷氨酸损伤SH-SY5Y细胞 确定最佳配伍比例以表1、表2结果分析SH-SY5Y主成分。进行适应性检验，KMO度量=0.370，Bartelett值=86.385，P=0.000，即相关矩阵不是一个单位矩阵，因此考虑进行因子分析(表5)。当主成分的累计贡献率≥70%时，则保留相应成分。如表5所示，前两个的累计贡献率为90.580%，因此可以用前两个主成分代替原来的检测指标。经过主成分分析后计算得出，最终7个配伍组的得分由高到低为：Gas：Dio=10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，0：10。

表3 不同组分配伍比例对缺氧损伤HUVECs存活率的影响

2.3.2用缺氧HUVECs确定最佳配伍比例 以表3，表4结果分析HUVECs主成分。进行适用性检验，KMO度量=0.500，Bartelett值=4.074，P=0.000，即相关矩阵不是一个单位矩阵，因此考虑进行因子分析。如表6所示，第一个成分的贡献率为72.230%，因此可以用第一个主成分代替原来的检测指标。经过主成分分析后计算得出，最终7个配伍组的得分由高到低为：Gas：Dio=8：2，10：0，9：1，7：3，6：4，5：5，0：10。

表4 不同组分配伍比例对缺氧HUVECs内ROS含量的影响

表5 SH-SY5Y主成分的特征值和贡献率

2.3.3优选最佳配伍比例 综合“2.3.1”项和“2.3.2”项的结果，当Gas和Dio的比例为10：0，8：2和9：1时，效果较好。当Dio存在时，可以抑制细胞的凋亡，增加正常细胞的比例，通过降低ROS的含量参与调控氧化应激，表明Dio具有一定的积极作用，因此，本研究中Gas和Dio最佳配伍比例可能为8：2[12]或9：1。

2.4最佳配伍组对缺氧HUVECs凋亡的影响 与正常组比较，模型对照组的正常细胞的比例显著降低，早凋和晚凋、坏死细胞的比例显著增加(P<0.05)。给药后，正常细胞的比例由59.17%增加到68.80%(P<0.01)；早期凋亡细胞比例由17.97%降低到14.23%(P<0.05)，晚期凋亡和坏死的细胞比例由21.8%下降到16.3%(P<0.01)。见表7。

表6 HUVECs主成分的特征值和贡献率

2.5最佳配伍组对缺氧诱导后HUVECs的VGEF、HIF-1α、iNOS、eNOS表达的影响 如表8、图2所示，与正常对照组比较，模型对照组HUVECs的VEGF增加，无显著性差异，HIF-1α、iNOS的表达显著增加，eNOS的表达显著减少(P<0.05)，给药后，VEGF、HIF-1α、iNOS的表达显著减少，eNOS的表达显著增加(P<0.05)。

3 讨论

当脑组织严重缺血缺氧时，Na+-K+-ATP酶功能减弱导致胞外Cl-和Na+内流，K+外流，细胞膜电位随之下降，激活电压依赖性的Ca2+通道，Ca2+内流，囊泡内的谷氨酸被释放出来，谷氨酸浓度增加会激活其受体，导致神经细胞离子流动性改变，线粒体功能紊乱，进一步引发NO和自由基的氧化损伤、蛋白酶释放，神经细胞发生凋亡、坏死和自噬[13]。本实验结果显示，随着Dio比例增加，Glu损伤的SH-SY5Y细胞的存活率降低，猜测Dio可能通过以下两点发挥对Glu损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用：①可以抑制细胞内线粒体脱氢酶的活性，降低细胞内氧化还原能力，通过降低损耗对损伤细胞发挥保护作用；②影响Na+-K+-ATP酶功能，使细胞凋亡坏死。

血管内皮细胞沿血管壁呈单层分布于血管腔内表面，具有多种生理功能，可以参与营养物质的运输，调控凝血、血栓等，对缺氧较为敏感，成为缺氧时的首要受累细胞。内皮细胞缺氧时，ROS的含量明显增多，并且引起炎症反应、氧化应激等，加速细胞的凋亡[14]。本实验在研究Gas与Dio不同配伍比例对缺氧HUVECs内ROS含量的影响时发现，各配伍比例均可不同程度地降低缺氧细胞中ROS的含量，且均差异有统计学意义，随着Dio比例增加，ROS的降低更为明显。由以上结果推测，Dio可以通过降低细胞线粒体内的脱氢酶活性，减少氧化还原反应的发生，减少细胞内ROS的含量发挥对缺氧内皮细胞的保护作用。

表7 最佳配伍组对缺氧HUVECs凋亡的影响

表8 Western blotting扫描结果

A.VEGF；B.HIF-1α；C.iNOS；D.eNOS；①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。

氧化应激在中枢神经系统退行性疾病的病理进程中发挥着重要的作用，缺氧导致的氧化还原失衡会诱导内源性ROS的产生，进而导致细胞毒性，诱导细胞凋亡或退化[15]。eNOS正常状态下仅产生少量的NO，可调节神经系统的功能，当细胞处于缺氧状态时，iNOS的表达增加，产生大量NO，诱导VEGF的表达，最终导致血管新生[16]。HIF-1α作为血管生成的刺激因子，在缺氧条件下表达显著增加，血管生成增加，可部分恢复缺血部位的供血情况，在缺氧适应方面发挥重要作用，而HIF-1α一旦过度表达，会导致血管生成过度增加，对病理性部位造成进一步损伤。给药后，HIF-1α和VEGF表达降低，表明最佳配伍组能够有效控制血管新生，避免血管新生过度造成的不良影响；最佳配伍组可以降低缺氧HUVECs中iNOS的表达，增加eNOS的表达，使二者趋于正常水平，表明Gas和Dio配伍之后能够通过调控氧化应激水平，降低细胞内ROS的含量，使细胞氧化还原处于平衡状态。因此，最佳配伍组可以降低缺氧HUVECs的凋亡，控制缺氧造成的血管新生，并且通过调控氧化应激，使缺氧细胞的氧化还原恢复正常水平。

遵循本课题组前期提出的民族药组方优化基本原则[17]，本实验利用基线等比增减设计法确定了Gas和Dio的7种配伍比例，并利用主成分分析方法确定Gas和Dio可能的最佳配伍比例为8：2或9：1，Dio可能通过作用于线粒体内的脱氢酶和细胞的Na+-K+-ATP酶发挥其对Glu损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用，将Gas和Dio的配伍比例8：2作用在缺氧HUVECs，可以通过抑制凋亡、氧化应激、血管新生途径参与对缺氧HUVECs的保护作用。