雌激素在椎间盘退变中的抗细胞凋亡作用

2021-11-30张池宋凯丁凡

国际骨科学杂志 2021年4期

张池宋凯丁凡

椎间盘作为人体最大的无血管组织，由连接椎体的纤维软骨组成。这种纤维软骨组织可分为纤维环软骨(AF)、髓核(NP)和软骨终板(EP)。作为类固醇激素，雌激素主要在卵巢中产生，小部分由肾上腺、雄性睾丸和脂肪组织产生。妇女体内有3种雌激素，即雌酮(E1)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)。E2是女性体内主要有效的雌激素[1]。雌激素的生理作用主要通过雌激素受体(ER)来实现。ER家族中有2种经典的亚型，即ERα和ERβ[2]。近期有研究检测到G蛋白偶联跨膜受体30(GPR30)也在人脊柱中表达[3]。退化椎间盘细胞的行为改变、数量减少和细胞外基质(ECM)降低与椎间盘退变(IVDD)启动高度相关，椎间盘细胞过度凋亡导致的细胞密度降低和ECM分解代谢[4]均在IVDD中起关键作用。IVDD中发生最重要的生化变化是蛋白聚糖损失[5]。在IVDD中，大量椎间盘细胞经历了程序性细胞死亡。目前认为NP细胞异常凋亡和加速衰老是与IVDD相关的主要细胞过程[6]，这意味着NP细胞凋亡可能是治疗IVDD的重要靶标。而雌激素可以通过抑制椎间盘细胞的异常凋亡来有效缓解IVDD进展。

1 抑制炎症因子

椎间盘发生炎症时，白细胞介素 (IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-6等炎症介质产生加剧，可促进ECM降解，引起椎间盘细胞衰老和死亡，从而导致椎间盘生物力学功能受损[7-8]。炎症介质被认为是IVDD发生发展过程中的关键因素，目前由IL-1β和TNF-α引起的炎症事件一直被认为在IVDD发生发展过程起着关键作用[8]，且IL-1β和TNF-α及其受体在人椎间盘组织中表达，IL-1β和TNF-α水平随着体内IVDD程度的加剧而增加[9-10]。研究证实，IL-1β和TNF-α可引起椎间盘细胞凋亡，是诱导ECM变性的原因[11]。同时，椎间盘中胶原蛋白和聚集蛋白聚糖生成也可受TNF-α抑制[12]。Liu等[13]报道，雌激素可减轻TNF-α诱导的人NP细胞凋亡。Wang等[14]研究证实，17β-E2通过刺激磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶b(Akt)信号转导通路保护人NP细胞免受TNF-α诱导而发生凋亡。Li等[6]研究发现，TNF-α可刺激大鼠NP细胞p53和p16表达，下调ECM含量，并产生活性氧(ROS)；补充雌激素可增强NP细胞增殖活性，增加聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达。Wang等[15]研究雌激素对IL-1β诱导的AF细胞凋亡的影响，发现雌激素可减弱IL-1β诱导的AF细胞凋亡，并促进炎症刺激下AF细胞存活和增殖，这表明雌激素能下调IL-1β活性。Yang等[16]通过给予IL-1β确定雌激素在体外对NP细胞的作用，结果显示IL-1β可促进基质金属蛋白酶(MMP)-3和MMP-13高表达，并抑制金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)表达，不仅加重ECM变性，而且下调Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖表达，并抑制NP细胞活力和黏附能力，而雌激素通过调节MMP与TIMP之间的平衡，并逆转Ⅱ型胶原蛋白合成的降解，对NP细胞凋亡起保护作用。 TIMP通过抑制MMP活性在维持ECM稳态中起重要作用。IL-1β破坏MMP与TIMP之间的平衡可能是IVDD进展的潜在机制。Yang等[16]研究显示，给予IL-1β不仅加重ECM变性，而且下调Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖表达，并抑制NP细胞活力和黏附能力，而雌激素能逆转这一过程。通常炎症在体内外对椎间盘都是有害的，而雌激素可能有助于减轻IVDD炎症发展。越来越多的研究表明，雌激素可能在体外炎症条件下通过ERβ促进大鼠椎间盘细胞活化和增殖。然而，目前尚未见雌激素如何发挥抗炎作用来保护体内椎间盘的报道。

2 调节体内氧化水平

Jin等[17]研究更年期妇女椎间盘氧化还原平衡，发现抗氧化剂能力因雌激素减少而降低。这些抗氧化剂紊乱会导致氧化应激，从而可能导致椎间盘受损。而雌激素可以增强抗氧化剂能力，血清中的雌激素水平与氧化还原平衡呈负相关。近期有体外研究表明，高糖培养的NP细胞通过氧化损伤对自身生物学产生不利影响，如降低细胞活力和促进ECM降解[18-19]。Yang等[20]研究显示，在高糖模型下补充雌激素可减轻NP细胞凋亡，并上调NP基质产生；雌激素可逆转高糖诱导的NP细胞内ROS异常产生。宁胜华[21]研究认为，17β-E2可以剂量依赖性方式有效保护大鼠NP细胞免受过氧化物诱导而发生凋亡，这表明17β-E2具有预防IVDD发展的潜力或可减慢其进程。

3 通过p38 MAPK信号转导通路调节ECM合成

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是将细胞外刺激转化为细胞生物学反应的关键蛋白[22]。有研究表明，p38 MAPK信号转导通路在椎间盘NP区域内的ECM合成和细胞活性中起着重要作用[23-24]。此外，多项研究表明E2可激活p38 MAPK信号转导通路[25-26]，且ERβ参与此通路的激活[27]。因此，ERβ与p38 MAPK信号转导通路可能是相互联系的。Li等[28]采用免疫染色法和糖胺聚糖(GAG)含量分析研究NP细胞中的ECM合成，结果表明E2以浓度依赖性方式促进NP细胞中的ECM合成，且随着E2浓度升高，p38 MAPK信号转导通路激活也增加；进一步分析表明，ERβ激动剂ERβ041和ERβ拮抗剂PHTPP可分别增强和抑制E2对NP细胞ECM合成的影响，而抑制p38 MAPK信号转导通路可显著消除E2对ECM合成的影响，证实了雌激素可通过p38 MAPK信号转导通路调节ECM合成。

4 上调PI3K/Akt信号转导通路

Wang等[14]将NP细胞分为对照组、TNF-α组、预处理17β-E2的TNF-α组及预处理17β-E2的TNF-α和MK2206(Akt途径抑制剂)组，结果显示雌激素可有效保护NP细胞免受TNF-α诱导而发生凋亡，且给予TNF-α和17β-E2后，磷酸化Akt表达通常以时间依赖性方式增加，而MK2206抑制了17β-E2的抗凋亡作用，因此认为雌激素通过上调PI3K/Akt信号转导通路减少NP细胞凋亡。另一项研究也表明，E2和白藜芦醇(一种天然的多酚化合物，被称为植物雌激素)通过PI3K/Akt信号转导通路对抗大鼠NP细胞中IL-1β诱导的凋亡；单独使用E2和白藜芦醇时，两者均可降低NP细胞凋亡发生率，而E2与白藜芦醇联合使用可更有效地减少NP细胞凋亡[29]。但由于E2具有较高的癌症风险，而白藜芦醇具有较低的癌症风险，两者作用相反，因此两者联用的致癌性尚不清楚，需对其不良反应进行进一步研究。

5 促进自噬

研究发现，在无血清培养基中进行细胞培养是一种构建饥饿细胞模型的方法，血清剥夺可减少细胞代谢的能量，不仅可上调NP细胞中MMP-3和MMP-13的表达，诱导NP细胞凋亡，而且可诱导NP细胞自噬，同时不同浓度的E2可抑制MMP表达，减少NP细胞凋亡，而此时血清剥夺下的自噬水平进一步上调，表明雌激素可通过促进自噬降低NP细胞凋亡[30]。

6 上调整合素表达

氟喹诺酮类药物已被证明具有广泛的抗菌作用，且其毒性反应相对较低。但由于在临床中的广泛应用，它们对骨骼系统的毒性反应引起了学者们的重视[31]。近期有研究表明，氟喹诺酮类药物具有一定程度的细胞毒性，可以在体外诱导细胞凋亡[32-33]。Yang等[34]使用左氧氟沙星构建细胞凋亡模型以研究雌激素对大鼠NP细胞的保护作用，结果显示左氧氟沙星不仅增加了NP细胞凋亡的百分比，而且还通过下调整合素α2β1表达，降低NP细胞与Ⅱ型胶原蛋白结合的能力。整合素α2β1是整合素β1家族的一种亚型，具有介导细胞与细胞质基质成分相互作用的能力[35]，并可特异性地结合Ⅱ型胶原[36]。雌激素对左氧氟沙星诱导的NP细胞凋亡的保护作用具有剂量和时间依赖性，可以逐渐调节整合素α2β1表达，同时增强NP细胞的黏附能力[34]。此外，Zhao等[37]也报道了E2通过整合素α1介导的Ⅰ型胶原黏附作用保护大鼠AF细胞凋亡。

7 抑制MMP

ECM分子包括Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖和其他基质蛋白，这些分子可以连续合成并被局部存在的蛋白酶降解，以维持体内稳态。但是，当平衡遭到破坏时，降解产物可能导致炎症，包括MMP-3和MMP-13在内的细胞内MMP是椎间盘变性期间ECM降解的最主要酶，可特异性降解ECM成分，促进IVDD[38-39]。Yang等[16]对体外培养细胞采用TUNEL法和膜联蛋白V/PI双染色法检测细胞凋亡情况，发现IL-1β可显著诱导细胞凋亡，其可减弱细胞活力并降低结合能力，同时E2可消除所有检测到的IL-1β作用；使用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)进一步发现，IL-1β下调Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、TIMP-1水平，上调MMP-3和MMP-13水平，证实雌激素通过下调MMP水平减少NP细胞凋亡。随后Liu等[40]在大鼠椎间盘穿刺模型中发现，17β-E2在大鼠体内也可通过下调MMP-3和MMP-13水平及上调Ⅱ型胶原蛋白水平有效缓解IVDD进展。

8 线粒体途径

线粒体途径受核因子(NF)-κB和Bcl-2等蛋白的调节[41-44]。研究表明，IL-1β与血清剥夺一起对大鼠NP细胞具有毒性作用，其特征在于细胞凋亡增加和Ⅱ型胶原结合能力降低。与IL-1β相反，E2可保护大鼠NP细胞避免凋亡，其特征在于Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖合成增加及细胞活力和结合能力增强。同时，抗凋亡基因Bcl-2表达水平经IL-1β处理后上调，而经E2处理后明显降低[16]。研究报道，NF-κB活化可促进调节各种细胞过程(包括增殖、生长和黏附)的分子表达，炎症因子TNF-α可显著促进NP细胞中ROS生成，而E2可显著降低经TNF-α处理的NP细胞中的ROS生成[6]。Li等[6]进一步分析了NP细胞的NF-κB活性，结果表明与对照NP细胞相比，经TNF-α处理的NP细胞中NF-κB活性增加，而E2可抑制经TNF-α处理的NP细胞中的NF-κB活性，此外E2对NF-κB活性的作用可受ER拮抗剂ICI 182780抑制；因此推测，NF-κB信号转导通路可能参与E2对TNF-α诱导的NP细胞衰老的保护作用。众所周知，Bcl-2和NF-κB参与线粒体凋亡的调控。因此，雌激素可能是通过线粒体凋亡来减少椎间盘细胞凋亡，其相关机制还需进一步研究加以证实。