长链非编码RNA在肾细胞癌中作用机制的研究进展

冯豪双，张宪方，熊俊，冀凯宏，徐莎,3

(1.海军军医大学基础医学院 a.学员六队，b.组织胚胎学教研室，上海 200433； 2.上海市胰腺疾病研究所，上海 200433；3.海军军医大学转化医学研究中心干细胞与再生医学研究室，上海 200433)

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，在泌尿系统肿瘤中发病率居第三位，并呈逐年上升趋势[1]。目前手术切除是治疗RCC最有效的方法，但大部分患者在确诊时已进展至中晚期，且肿瘤对放化疗及免疫治疗不敏感，而靶向治疗存在短期耐药现象，通常RCC患者的预后较差[2-3]。RCC的发生发展过程受诸多因素影响，且其本身也是多基因相关性肿瘤，基因表达调控网络的异常改变也是导致RCC的重要原因之一[4]。基因表达调控受基因水平、转录水平和翻译水平三方面的影响，同时转录产物和蛋白产物的降解也决定基因表达量。非编码RNA的发现及其功能的揭示丰富了对基因表达调控的认识。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，因缺乏有意义的开放阅读框而不具备编码蛋白的功能，所以最初被认为是基因组转录时的“噪音”，无生物学功能活性[5]。近年来研究发现，lncRNA具有组织和细胞特异性，在正常发育和疾病中扮演重要角色。lncRNA在肿瘤中常异常表达，发挥促癌或抑癌作用，参与癌症的发生、发展及浸润转移[6]。深入了解lncRNA在RCC中的作用机制，有助于阐明RCC的发生发展过程。现就lncRNA在RCC进程中的调控机制这一视角，分别从lncRNA与微RNA(microRNA，miRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、蛋白等相互作用参与基因表达调控网络的多种维度，总结lncRNA在RCC发生发展中的作用机制，探讨潜在的临床应用价值。

1 lncRNA的结构与功能

lncRNA的结构与mRNA类似，5′端和3′端分别存在7-甲基鸟嘌呤帽子和poly A尾，大多需要剪接才能成为成熟分子[7]。lncRNA的一级结构保守性差，但二级、三级结构具有高度保守性，这些高保守的特定核苷酸序列或空间结构往往与其复杂的生物学功能密不可分[8]，如部分lncRNA的双茎环结构参与染色质重构，三叶草结构参与大脑发育过程[9]。随着研究的深入发现，lncRNA在X染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活与干扰等方面发挥重要的调控作用[10-12]。lncRNA的作用模式可以归纳为以下4种[13]：①作为信号分子，lncRNA在特定信号通路下转录后，直接结合邻近部位的DNA，调节基因表达。如lncRNA KCNQ1DN(KCNQ1 downstream neighbor)抑制c-Myc启动子的转录活性[14]。②作为引导分子，lncRNA与结合蛋白(通常为转录因子)结合后定位到特定的序列上，以顺式或反式作用介导转录调控。如lncRNA肿瘤易感性候选基因15与转录因子YY1结合定位到Y染色体性别决定区框4 启动子区增强其表达[15]。③作为诱饵分子，lncRNA可竞争性结合蛋白或miRNA，阻断相应分子的作用及下游信号通路。如lncRNA 尿路上皮癌胚抗原1能与核不均一核糖核蛋白Ⅰ结合，从而阻断核不均一核糖核蛋白 Ⅰ 对细胞周期负性调控因子p27kip1的翻译调控[16]。④作为支架分子，类似蛋白复合体的骨架，多个相关蛋白结合至同一条lncRNA分子上，实现不同信号通路之间的信息交汇与整合。如lncRNA 细胞周期蛋白激酶抑制剂4基因座的反义RNA是典型的支架分子，其结合并募集多梳蛋白复合体1和复合体2，导致染色质状态改变，从而抑制下游基因的表达[17]。以上4种作用模式相互关联，协同发挥lncRNA的功能。

2 lncRNA与RCC

系统lncRNA表达谱分析显示，RCC中存在大量lncRNA的异常表达[18-19]，引起蛋白表达和功能以及相应的细胞信号通路改变，与RCC的发生发展、诊断、预后及耐药性密切相关。如具有促癌作用的lncRNA肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)[20-21]，具有抑癌作用的lncRNA分化拮抗非蛋白质编码RNA[22]，可作为潜在的无创血清学指标的lncRNA uc009yby.1和ENST0000050687[23]，与患者远期生存率相关的lncRNA NONHSAT123350[2]，与治疗耐药性相关的生长阻滞特异性转录因子5[24]等。这些lncRNA在RCC中的作用模式主要是以顺式作用或反式作用的方式与各类RNA分子[14,25-26]、蛋白相互作用[21,27-28]，参与组蛋白修饰[29-30]，在转录水平、转录后水平、表观遗传水平对基因表达进行调控。与其他较小的非编码RNA相比，lncRNA具有较长的序列以及复杂的空间结构，其在基因调控机制中所扮演的角色具有多样性和复杂性。

2.1lncRNA与miRNA的相互作用 miRNA是一类由基因编码的长度为20～24个核苷酸的非编码单链RNA分子，通常与靶基因转录体序列互补，参与基因的转录后调控。lncRNA与miRNA之间可通过碱基互补配对原则发生特异性结合，形成复杂而微妙的基因表达调控网络。2011年，Salmena等[31]提出竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假说，认为RNA之间可通过竞争结合共同的miRNA反应元件实现相互调节。随着研究的深入，越来越多的lncRNA被发现可作为ceRNA影响RCC疾病相关的生物学行为。lncRNA生长阻滞特异性转录因子5因在生长停滞细胞中高表达而得名，在多数肿瘤组织中低表达，并作为重要的抑癌基因在RCC中调控多种生物学过程。生长阻滞特异性转录因子5通过吸附以人锌铁调控蛋白-1为靶点的miR-223，影响细胞周期进程、诱导细胞凋亡[32]；功能丧失和功能获得实验发现，生长阻滞特异性转录因子5作为ceRNA介导miR-21/Y染色体性别决定区框5途径，进而影响RCC细胞对索拉非尼的耐药[24]。此外，牛磺酸上调基因1、锌指结构反义转录本1等也被证实能作为ceRNA影响RCC细胞的生物学行为以及耐药性[26,33-34]，这为解决RCC临床耐药提供了参考依据，并为RCC的临床治疗提供了新靶点。

此外，miRNA又可反向调控lncRNA。lncRNA MALAT-1首先在非小细胞肺癌中被发现，并在多种肿瘤组织包括RCC中表达上调[35]。MALAT-1通过靶向miR-22-3p使其表达下调，激活下游信号通路促进肾透明细胞癌细胞增殖和迁移[25]；研究还发现miR-22-3p抑制剂能显著上调MALAT-1的表达，表明lncRNA与miRNA之间存在双向调控。多条lncRNA也可以靶向同一条miRNA，miR-137是lncRNA锌指蛋白多型2反义链1和lncRNA核仁小分子RNA宿主基因1的共同靶标，miR-137受到这两条lncRNA的负调控，进而协同影响RCC的发生发展过程[36-37]。

2.2lncRNA对mRNA的调控作用 lncRNA可通过碱基互补配对与基因启动子直接结合，进而影响下游mRNA的转录过程。Yang等[14]报道，lncRNA KCNQ1DN经与c-Myc启动子区的序列结合，导致c-Myc转录受阻，从而抑制RCC细胞在体内和体外的生长。此外，lncRNA也能招募转录因子至邻近靶基因的启动子，在转录水平调控靶基因的表达。临床上使用索拉菲尼治疗RCC常出现耐药，其原因在于高表达的肾癌索拉非尼耐药相关的lncRNA募集核因子κB至白细胞介素-6的启动子区并促进其转录，从而激活下游信号通路，引起RCC细胞对索拉非尼的耐药[38]。Song等[39]的研究表明，高表达的被转化生长因子-β活化的lncRNA与DNA甲基转移酶1蛋白结合后，增加DNA甲基转移酶的稳定性，提升DNA甲基转移酶与p53启动子区的结合能力，下调p53转录水平，增加RCC细胞的增殖和迁移速率并抑制细胞凋亡。lncRNA也可通过招募RNA结合蛋白，在转录后水平共同实现对靶基因的调控。FoxO基因诱导的lncRNA 1是一种与能量应激相关的lncRNA，与富含AU碱基的RNA结合蛋白1相互作用后阻断下游c-Myc mRNA的翻译，导致葡萄糖摄取以及乳酸产量减少，促进RCC细胞凋亡[40]，表明lncRNA作为负调节子在肿瘤发展中参与能量代谢相关的新的调控机制。另外，还有由蛋白编码基因的反义链转录而来的lncRNA能提高反义链mRNA的稳定性。lncRNA表皮生长因子受体反义链1(epidermal growth factor receptor antisense RNA 1，EGFR-AS1)是EGFR的反义转录物，与EGFR具有部分序列互补性，EGFR-AS1通过与人抗原R结合以维持EGFR mRNA的稳定性，促进RCC细胞的增殖和转移[41]，提示EGFR-AS1可作为一个较为理想的药物靶点。

2.3lncRNA与蛋白之间的相互作用 lncRNA具有相对较长的核苷酸链，其分子内部可形成特定而复杂的二级空间结构，能提供与蛋白结合的多个位点，影响蛋白的稳定性和活性。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)是第一个被发现具有反式调控作用的lncRNA，由HOX基因座转录而来[42]，通过多种调控通路发挥生物学功能。除作为ceRNA吸附miRNA以及参与表观遗传调控外[43-44]，研究还发现HOTAIR与Salvador同源物1直接结合，导致该蛋白功能丧失，进而激活下游Hippo信号通路，促进肿瘤细胞增殖[27]。lncRNA SARCC(suppressing androgen receptor in renal cell carcinoma)与雄激素受体结合后导致稳定性下降，雄激素受体活性降低，进而阻遏下游信号途径，实现对RCC细胞侵袭、迁移和增殖的调控[29]。lncRNA MALAT-1通过lncRNA-蛋白质相互作用和稳定蛋白质引起Livin蛋白质上调，共同介导RCC细胞增殖，并促进转移[21]。由此可见，lncRNA与蛋白之间的直接相互作用是调控肿瘤发生发展的一种普遍机制。

2.4lncRNA介导的表观遗传调控 细胞遗传信息的表达既有赖于基因组DNA序列，也受制于表观遗传学信息。表观遗传调控是通过修饰基因而非改变基因序列实现基因表达的改变，主要在DNA修饰、组蛋白修饰、染色质重构等方面介导基因表达，其调控异常在肿瘤的发生发展中较常见[45-46]。lncRNA可通过与多种表观遗传复合物相互作用，介导下游DNA的甲基化、组蛋白修饰等，从而抑制或激活基因的表达。Hirata等[29]研究证实，敲低MALAT-1后可引起与其结合的果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)表达减少，降低了下游上皮钙黏素启动子区组蛋白H3的27位赖氨酸甲基化水平，上调上皮钙黏素的表达，进而抑制RCC细胞上皮-间充质转化。这种经甲基化水平影响下游基因表达的机制也同样存在于与肿瘤不良预后相关的lncRNA TP73反义RNA 1和KiSS-1转移抑制基因启动子区[47]。lncRNA HOXA远端转录本可作为分子支架，同时招募EZH2和赖氨酸特异性去甲基化酶1与之结合，协同调控肿瘤抑制激酶2基因的沉默，从而影响RCC细胞的生长和凋亡[30]。lncRNA HOTAIR既能与miRNA和蛋白相互作用，又能通过重构染色质结构促进RCC细胞转移。敲低HOTAIR可引起组蛋白脱甲基酶含Jumonji结构域蛋白3的减少，导致其下游靶基因Snail转录因子表达下调，而组蛋白甲基转移酶EZH2靶基因原钙黏蛋白β5表达增加[40]。以上研究表明，HOTAIR作为RCC转移的重要启动子，通过影响不同基因位点的组蛋白甲基化和去甲基化，双重调节染色质状态。另外，lncRNA参与下游基因的乙酰化修饰也得到证实。

由溶质载体47家族第2成员(solute carrier family 47,member 2，SLC47A2)基因座转录而来的lncRNA SLC47A2基因非mRNA转录本1能与脯氨酸-谷氨酰胺富含性剪接因子/E2F转录因子1/组蛋白去乙酰化酶复合体结合形成功能性lncRNA-蛋白复合物。在邻近肿瘤的癌旁组织中，SLC47A2基因座高表达SLC47A2基因非mRNA转录本1，诱导脯氨酸-谷氨酰胺富含性剪接因子/E2F转录因子1/组蛋白去乙酰化酶复合体与SLC47A2启动子区的脱靶，引起启动子区高水平的组蛋白H3的27位赖氨酸乙酰化修饰，同时也增强了RNA聚合酶Ⅱ与启动子区的结合；相反，RCC中低表达的SLC47A2基因非mRNA转录本1则增强了脯氨酸-谷氨酰胺富含性剪接因子/E2F转录因子1/组蛋白去乙酰化酶复合体在SLC47A2启动子区的结合，导致SLC47A2编码区表达沉默[48]。表观遗传学的某些改变具有可逆性，这为靶向表观遗传治疗疾病提供了理论依据。但目前缺乏针对表观遗传治疗的特异性基因位点，且lncRNA作用的时空特异性、自身的分子状态等也需要深入研究。

3 结 语

随着全转录组测序和lncRNA芯片技术的不断升级以及生物信息学技术的发展应用，更多与RCC相关的lncRNA陆续被发现和研究。除上文提及的lncRNA与miRNA、mRNA、蛋白相互作用发挥功能以及调控表观遗传外，还可能有许多未知的分子类型与lncRNA存在互动，尤其是lncRNA之间的相互影响。lncRNA是否具有翻译成蛋白质的能力是近年备受争议的问题。Lu等[49]提出了由“非编码”基因编码的隐藏的人类蛋白质组，发现lncRNA编码的新蛋白质偏离了具有各种物理和化学特性的已知规范蛋白质，在进化过程中主要出现在灵长类动物中，其中新蛋白质UBAP1-AST6位于核仁中并优先由肺癌细胞系表达，具有与细胞增殖相关的功能，这一发现更加拓展了lncRNA的生物学功能。lncRNA因数量多、物种间保守性较差、组织特异性及特定的细胞定位等导致对其作用机制的研究较为困难。从表型入手探究某一分子的作用机制是常用的研究手段，但lncRNA的生物学功能也离不开其一级结构和高级结构，因此对lncRNA结构的解析是深入研究其功能的另一条途径。

针对特异性lncRNA靶点的治疗方案以及靶向特异性lncRNA改善化疗将是未来研究的一个方向。除了进一步对lncRNA在细胞和动物模型水平的机制进行更深入的研究外，还需要针对药物设计、药物疗效及药物生物安全性方面进行摸索与评价，以研发出靶向特异性lncRNA的药物，从而为临床治疗RCC提供更多安全有效的治疗方法，真正实现从基础研究到临床应用的转化。