微粒在血栓性疾病中的研究进展

孙宇婷，高春艳

(哈尔滨医科大学(大庆)，黑龙江 大庆 163319)

随着我国人口老龄化的进一步加剧以及人们生产和生活方式的改变，血栓性疾病已经逐渐成为严重威胁人类身体健康的疾病。根据发病部位，血栓性疾病可分为动脉血栓、静脉血栓和微循环障碍等类型。血栓性疾病多由血管内皮损伤、血液高凝状态和血流缓慢等因素引起。研究表明，微粒与血栓性疾病的发生、发展密切相关[1-2]。微粒是细胞活化或凋亡时细胞膜表面释放的直径为0.1～1 μm的囊泡，来源于血小板、红细胞、白细胞、内皮细胞以及癌细胞。正常人循环中有一定数量的微粒，血栓性疾病患者循环微粒水平显著高于正常人[1-2]。微粒不仅能表达具有很强促凝活性的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和组织因子，而且还富含亲代细胞抗原和信使RNA等多种生物活性物质[3]。微粒通过表面相互作用、受体激活和细胞融合等方式作用于靶细胞，继而影响血栓性疾病的进程[4]。现就微粒在血栓性疾病中的研究现状以及作用机制进行综述，以期更好地预防和治疗血栓性疾病。

1 微粒的概述

1.1微粒的产生 微粒是细胞活化或凋亡的产物。在静息状态下，细胞自发的跨膜双分子层的脂质转运非常缓慢。磷脂在脂质上分布的不对称性是静息细胞的共同特征：PS和磷脂酰乙醇胺被限制于质膜的内侧；磷脂酰胆碱、神经鞘磷脂和鞘糖脂等被隔离到质膜外侧。这种不对称性是内向翻转酶和外向翻转酶的相反活动以及非特异性双向ATP非依赖性脂质转运体共同作用的结果。当细胞受凝血酶或钙离子激动剂等刺激导致细胞活化或凋亡时，内向翻转酶发生钙依赖性抑制，外向翻转酶和非特异性双向ATP非依赖性脂质转运体被激活，导致PS外翻[5]。细胞骨架的钙依赖性蛋白水解导致质膜内外侧的磷脂水平的最终瞬态失衡：PS外翻、磷脂酰胆碱水平降低和神经鞘磷脂逆向转运[6]。这些引起质膜的不稳定以及微粒释放。另外，钙依赖性通道TMEM16F是一种八跨膜蛋白，其在钙离子引起的血小板微粒形成过程中起关键作用[7]。

1.2微粒的生物学功能 微粒具有很强的促凝活性，其促凝血功能与PS和组织因子的表达有关。微粒暴露的PS与凝血因子FⅤ、FⅧ的C样结构域选择性结合，为凝血因子FⅤ、FⅧ和FⅩ的活化提供催化表面，促进凝血酶的生成[8]。其次，微粒暴露的组织因子是人体内生理性凝血的主要启动因子，通过与凝血因子FⅦ/Ⅶa的相互作用启动外源性凝血[9]。血小板衍生微粒的促凝血活性是活化血小板的50～100倍[10]。这些特性是微粒在止血的生理过程和血栓形成的病理过程中起作用的基础。不仅如此，微粒携带的生物活性物质使其具有更为广泛的作用，包括致动脉粥样硬化、促炎、免疫调节，甚至抗凝。

1.3微粒的检测 随着检测技术的发展，越来越多方便快捷的技术被用于微粒的鉴定。目前微粒的检测技术包括流式细胞术、电子显微镜观察、酶联免疫吸附实验、蛋白组学技术等。

1.3.1流式细胞术 流式细胞术是检测微粒最常用的方法。一般情况下，通过已知大小的标准微球(直径为1 μm的标准微球)设门，确定微粒在流式散点图中的位置。由于膜联蛋白与微粒的亲和性，在研究中常用带有荧光染料的膜联蛋白来定义微粒。另外，由于不同种类的微粒也携带有各自亲代细胞的表面标志物，如血小板膜糖蛋白CD41a、内皮细胞膜糖蛋白CD31等。膜糖蛋白与带有荧光染料的膜联蛋白联合检测常用来确定微粒的来源。膜联蛋白在微粒的检测中广为应用，但膜联蛋白检测微粒可能存在的问题是微粒会在流式分析之前发生标本的“微凝集”。这是由于膜联蛋白检测微粒时需要加入钙离子，钙离子的加入可引起凝血级联反应的发生，最终导致纤维蛋白凝块“微凝集”形成，其形成大大减少了流式细胞仪检测到的微粒数量[11]。有学者使用带有荧光标记的乳黏素检测微粒[12-13]。乳黏素与微粒有较强的亲和性，且乳黏素与微粒结合时不需要钙离子的介入，该特点使乳黏素检测微粒更不易受钙离子的影响。在不考虑经济因素的情况下，乳黏素较膜联蛋白更加适合检测微粒。

1.3.2酶联免疫吸附实验 酶联免疫吸附实验也可用来检测微粒。一种方法是将膜联蛋白包被在微孔板的底部，然后将待测物加入微孔板中，清洗微孔板后，再次向微孔板中加入凝血酶原、Ⅹa因子、Ⅴa因子以及钙离子的混合物。微粒表面的PS可使凝血酶原在Ⅹa因子和Ⅴa因子的存在下活化为凝血酶。凝血酶的生成量利用特定的显色底物测定[14]。另一种方法是微粒结合到膜联蛋白包被的微孔板后，由于微粒表面暴露组织因子，利用组织因子的抗体及过氧化物酶检测微孔板中微粒的水平[15-16]。酶联免疫吸附实验的灵敏度不高，且无法明确微粒的数量，虽然较流式细胞术更为经济、实惠，但实验准确性无法保障。

2 微粒与血栓性疾病

2.1急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS) ACS是冠状动脉粥样斑块破裂引起的血栓性疾病，通常由动脉粥样硬化迁延而来。ACS患者的循环中具有高水平的微粒。巨噬细胞、红细胞和平滑肌细胞是粥样斑块微粒的主要来源。微粒的促凝活性参与了ACS的发生发展。Liu等[17]研究发现，ACS患者的微粒水平是健康对照者的2.5倍，这些微粒表达的PS和组织因子通过启动凝血级联反应促进血栓形成。此外，微粒还通过促炎作用参与ACS的发展。Mavroudis等[18]对将要进行经皮冠状动脉介入治疗的ACS患者的冠状动脉和右心房处的微粒水平和来源进行分析发现，病变处冠状动脉总体微粒水平较高，微粒部分来自白细胞。病变处冠状动脉具有更高水平的CD62P阳性和CD62E阳性微粒，这些微粒增加了血管炎症的可能性：CD62P阳性微粒通过进一步募集表达P-选择素糖蛋白配体的炎症细胞而促进病变进展[19]；CD62E阳性微粒与P-选择素糖蛋白配体结合介导炎症细胞与活化内皮细胞的相互作用[20]；中性粒细胞衍生的微粒可通过与活化的内皮细胞结合，放大血管炎症反应[21]。Diehl等[22]研究发现，溶血磷脂酰胆碱是血小板衍生微粒的主要成分，通过与血小板受体G2A受体相互作用，促进血小板的活化、扩散、迁移和聚集，最终导致血管炎症。该研究还发现，在动脉粥样硬化斑块不稳定或破裂的小鼠模型中，溶血磷脂酰胆碱可作为斑块不稳定的替代标志物。同样，人的溶血磷脂酰胆碱在易损斑块区也有较高的水平。推测微粒不但促进了血管炎症的发生，还与斑块不稳定性密切相关，微粒的产生增加了斑块的不稳定性，提高了ACS的发病风险。除促炎和促凝外，微粒还可通过携带信使RNA的方式促进ACS的发展。Liu等[23]发现，包装有miR-92a-3p的内皮细胞衍生微粒在ACS患者中显著增加，这些微粒促进了内皮细胞或血管平滑肌细胞的迁移和增殖，加剧了动脉狭窄。综上所述，微粒在ACS的发病机制中扮演重要角色，通过促炎、促凝和细胞间信息通信等方式参与疾病的发展。

2.2缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS) IS是目前致残率极高的疾病之一，是由于脑的供血动脉狭窄、栓塞、脑供血不足导致的脑组织坏死。微粒通过促凝和促炎作用参与了IS的发展。Yao等[24]研究发现，IS循环中高水平的微粒通过暴露PS和组织因子促进血栓形成。He等[25]研究发现，与健康对照者相比，IS患者循环中白细胞衍生微粒数量增加，这些微粒通过炎症作用促进IS的发展。白细胞衍生微粒的促炎作用主要通过升高肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、活化蛋白C和白细胞介素-1β等炎症因子的水平实现[26]。单核细胞/巨噬细胞衍生的微粒诱导核因子κB易位到细胞核中，导致白细胞介素-8产生增加[27]。另外，单核细胞/巨噬细胞衍生的微粒还可诱导脑微血管内皮细胞微粒的产生[28]。微粒不仅促进了IS的发生发展，还可调节神经系统的发育和再生。Varon等[29]发现，活化的血小板释放的微粒能够增强内源性神经祖细胞和干细胞血管的生成以及神经发生，有助于IS后的神经修复。Pan等[30]研究发现，内皮细胞衍生微粒对血脑屏障发挥作用。在IS的疾病过程中，常有血脑屏障的破坏，星形胶质细胞参与了血脑屏障的组成。正常培养条件下产生的内皮细胞衍生微粒促进星形胶质细胞的增殖，改善局部脑血流量，减少梗死体积；而在氧气和葡萄糖剥夺的培养条件下产生的内皮细胞衍生微粒对星形胶质细胞有完全相反的作用[30]。推测微粒在IS中不仅仅促使疾病恶化，其对神经细胞的修复也减轻了IS对机体的损害。

2.3静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE) VTE是指血液在静脉内病理性凝结导致血管完全或不完全阻塞，属静脉回流障碍性疾病。VTE包括深静脉血栓形成和肺血栓栓塞症。手术外伤、限制活动或静脉功能不全引起的静脉瘀滞等是导致VTE的病理性原因，以上因素易引起各种凝血因子和促凝物质在病变部位浓缩，促进VTE发生。癌症引起的VTE是近年研究的热点，而VTE也是癌症患者的常见并发症。许多研究探讨了来自癌细胞和癌症患者的微粒的促凝机制，但研究大多集中在组织因子的作用上。癌症患者组织因子阳性微粒的表达与VTE的发生发展可能存在相关性。Timp等[31]研究发现，癌症患者VTE的风险增加了4～7倍，这是由于循环中肿瘤细胞衍生的组织因子阳性微粒引起了高凝状态。Hisada等[32]将人源性胰腺癌细胞衍生微粒(pancreatic cancer cell-derived microparticle，pcMP)注入小鼠体内发现，pcMP促进了小鼠的VTE。目前，许多研究者已就肿瘤细胞衍生的组织因子阳性微粒促进VTE形成达成了共识。Stark等[33]认为，癌症相关VTE的发病机制为：①pcMP衍生的组织因子不足以诱导VTE；②活化的血管内皮细胞可能提供了部分组织因子，这些组织因子与pcMP衍生的组织因子协同促进了VTE的发生；③磷脂酰乙醇胺支持FⅩa的生成，对pcMP的促凝血活性有重要作用。Stark等[33]的研究结果与公认的“肿瘤细胞衍生组织因子阳性微粒促进VTE”有所不同，说明微粒促进癌症相关VTE的机制仍不完全清楚，需进一步探究。

2.4抗磷脂综合征(antiphospholipid-antibody syndrome,APS) APS是一种以反复动脉或静脉血栓、病态妊娠和抗磷脂抗体持续阳性为特征的疾病。APS的实验室检查中有诊断价值的抗磷脂抗体包括狼疮抗凝物、抗心磷脂抗体和抗β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ)抗体[34]。β2GPⅠ是APS的主要抗原。一直以来人们对微粒在APS中作用的认识仅限于β2GPⅠ参与清除循环中的微粒以及APS患者体内产生的微粒能够促进血栓形成[35]。Mobarrez等[36]提出了新观点，认为PS阴性微粒的积累可能参与了APS的发病机制，APS患者具有较健康对照者更低水平的β2GPⅠ阳性微粒。据推测，这可能是由于β2GPⅠ先与微粒表达的PS特异性结合，导致抗β2GPⅠ抗体与β2GPⅠ-PS的复合物结合。这一过程导致循环中β2GPⅠ阳性微粒水平降低，PS阴性微粒积累，微粒可能成为自身抗原的来源。以往很少有研究关注PS阴性微粒对APS的影响，Mobarrez等[36]的研究为APS的发病机制研究提供了新思路。

3 小 结

流式细胞术是目前检测微粒最常用的方法。微粒暴露的PS和组织因子通过内源性和外源性凝血途径促进血栓的形成。不仅如此，微粒还通过促炎、致动脉粥样硬化、细胞间信息通信等多种方式影响了ACS、VTE和IS等血栓性疾病的进程。近年来，越来越多的研究致力于将微粒作为血栓性疾病的生物标志物，但现今微粒的检测技术还存在较多缺点，未来需进一步优化微粒的检测技术。明确微粒在血栓性疾病中的作用机制，有助于预防和诊断血栓性疾病，以期降低血栓性疾病的发病率和致死率。