免疫检查点CTLA4和PD-1在急性胰腺炎发病机制中的作用

吴川林,汝继轩,白雪巍

(哈尔滨医科大学附属第一医院胰胆外科，哈尔滨 150001)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上常见的一种急腹症，其发病原因主要与胆石症、酒精、高脂血症和药物等因素相关。AP病情进展迅速，有5%～10%的患者会发展为重症AP。重症AP患者常合并全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭以及细菌感染等并发症，病死率高达30%[1-3]。在AP发病早期，大量的炎症因子被激活并释放入血，导致全身炎症反应。为了恢复免疫平衡，代偿性抗炎反应随之出现，并在病情发展过程中逐渐增强，导致机体出现免疫抑制，甚至引起后期感染性并发症[4]。近年来有研究指出，共抑制性免疫检查点是导致机体发生免疫抑制的重要组成部分，它与共刺激性免疫检查点共同组成了免疫系统的调节网络，对维持机体自身的免疫耐受以及防止过度的炎症反应具有重要意义[5]。其中细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)和程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1，PD-1)是免疫调节系统中作用最大、研究范围最广的共抑制性免疫检查点受体，甚至临床上已经批准使用相关免疫抑制剂进行癌症的治疗[6]。研究发现，共抑制性免疫检查点受体CTLA4和PD-1与AP密切相关，它们可以通过调节T淋巴细胞的功能参与AP的免疫调控[7]。现就CTLA4和PD-1共抑制性免疫检查点受体的结构、功能、激活途径以及在AP免疫反应中的作用机制进行综述。

1 CLTA4和PD-1的结构和功能介绍

1.1CTLA4的结构和功能 CTLA4又称CD152，是免疫蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要含有1个前导肽和3个结构域，即116个氨基酸的细胞外V型结构域，37个氨基酸的跨膜结构域和34个氨基酸的细胞内尾端结构域[8]。CTLA4主要在活化的T淋巴细胞上表达，虽然CTLA4是细胞膜的表面免疫调节受体，但主要存在于细胞内囊泡中，并通过内吞作用在细胞内囊泡与细胞膜之间循环[9]。此外，CTLA4在静息状态的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)上常规表达，并且在T淋巴细胞被激活后表达水平升高[10]。CTLA4与共刺激性受体CD28高度同源，能够与抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，APC)上的CD80/CD86配体结合[11]。CTLA4的免疫抑制信号对维持机体的免疫平衡具有重要作用。敲除CTLA4基因小鼠可迅速发展为淋巴细胞增殖性疾病，并伴有多器官淋巴细胞浸润和组织损伤，最终发生死亡[12-13]。当机体缺乏CTLA4的负性免疫抑制信号后，可能会引起淋巴细胞激活的阈值降低，从而导致自身免疫性疾病的发生。CTLA4的相关研究已经在类风湿关节炎、1型糖尿病和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的研究和临床治疗中取得了显著成效[14-15]。此外，CTLA4作为第一代免疫检查点的靶标，美国食品药品管理局自2011年起，批准将抗CTLA4免疫抑制剂用于黑色素瘤等肿瘤的相关治疗[16-17]。

1.2PD-1的结构和功能 PD-1是一种分子量为50 000～55 000的Ⅰ型跨膜蛋白，由细胞的可变型免疫球蛋白胞外结构域、跨膜结构域和执行信号转导功能的胞内结构域组成[18]。其中细胞内结构域含有两个重要的氨基酸信号序列：免疫受体氨基酸抑制序列和免疫受体氨基酸开关序列。PD-1主要在T淋巴细胞和B细胞中表达，也可在单核细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞中表达[19]。有研究表明，T淋巴细胞在受到刺激后数小时内即可在细胞表面表达PD-1，而无刺激状态的静止性T淋巴细胞则不表达PD-1[20]。程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)又称B7-H1，是PD-1的主要配体，也是Ⅰ型跨膜蛋白，主要由IgV样结构域、IgC样结构域、信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域组成。PD-L1可以在T淋巴细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞表达[19]。PD-1/PD-L1信号通路对肿瘤的免疫监视具有重要意义。在肿瘤微环境中，多种细胞因子可以诱导肿瘤细胞表达PD-L1,并通过结合T淋巴细胞的PD-1后抑制T淋巴细胞活性，从而逃避免疫系统对肿瘤细胞的免疫监视及清除[21]。针对PD-1/PD-L1在肿瘤免疫中的作用，美国食品药品管理局已经批准了多种靶向PD-1/PD-L1相关免疫抑制剂用于癌症的相关治疗[22-23]。此外，有研究显示，联合使用抗CTLA4和抗PD-1药物治疗肿瘤的效果更佳[24]。抗CTLA4主要通过提高淋巴细胞对肿瘤相关性抗原的识别能力发挥抗肿瘤效应，而靶向抗PD-1治疗可以直接激活CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞的直接杀伤作用[25]。

2 免疫检查点通过调节T淋巴细胞功能参与AP的免疫反应

2.1T淋巴细胞在AP中的作用及地位 免疫检查点调节机制作为免疫系统重要的调节方式，主要通过调节T淋巴细胞功能参与炎症反应。虽然在AP的发病早期主要是由中性粒细胞和巨噬细胞释放大量的炎症因子启动AP的炎症反应，但是T淋巴细胞在调节免疫细胞功能方面也发挥重要作用。Demols等[26]对T淋巴细胞缺乏的小鼠诱导发生AP，其胰腺损伤程度较对照组(无T淋巴细胞缺乏的正常小鼠)明显减轻，而将T淋巴细胞移植回T淋巴细胞缺乏的小鼠后，其病情与对照组相似。该团队进一步研究发现CD4+T淋巴细胞能够通过释放炎症介质激活巨噬细胞参与炎症反应，并且能够通过Fas-Fas配体途径发挥直接的细胞毒性作用。Yang等[27]发现CD4+T淋巴细胞与AP的病情发展密切相关，他们检测了69例并发器官衰竭的AP患者外周血中CD4+T淋巴细胞的水平，其中持续性器官衰竭患者CD4+T淋巴细胞数量明显减少，这可能是外周血中的淋巴细胞迁移至胰腺等炎症组织中所致，这些迁移的T淋巴细胞能进一步加重胰腺的炎症损伤。同时还发现，可以通过测量患者第1天外周血中CD4+T淋巴细胞的水平来预测AP的病情发展。这可能与CD4+T淋巴细胞的辅助性T细胞(T helper cell，Th细胞)1和Th17亚群细胞有关。这些细胞释放的γ干扰素、白细胞介素(interleukin,IL)-2和IL-17等促炎因子能够活化中性粒和巨噬细胞，进一步损伤胰腺组织[28-30]。而且活化的T淋巴细胞释放的大量炎症因子通过“扳机样反应”启动其他炎症因子的活化，诱导多种细胞因子发生瀑布样级联反应，促进了AP早期的全身炎症反应综合征。此外，CD4+T淋巴细胞还可以分化为具有抑炎作用的Th2和Treg细胞亚群，其中Treg细胞释放的IL-10是炎症反应中重要的抑炎因子，能够抑制腺泡细胞的坏死，并且还可以诱导巨噬细胞从促炎的M1型极化为M2型，降低炎症损伤[31-33]。

2.2免疫检查点对T淋巴细胞的调节作用 目前认为CTLA4主要通过竞争性结合CD28的配体发挥免疫抑制作用。当T细胞抗原受体(T cell antigen receptor，TCR)与主要组织相容性复合体结合时，CD28与CD80/CD86相互作用以增强TCR的信号转导，为T淋巴细胞的活化提供二级刺激信号。然而，当CD28及TCR被激活后，可以传递信号诱导CTLA4表达。随后APC上的CD80/CD86与亲和力更高的CTLA4受体结合，CTLA4再通过反式内吞作用去除CD80/CD86导致CD28的激活作用受损，从而发挥负性的免疫调节功能[9]。有研究发现，CTLA4与配体结合后可以诱导吲哚胺-2,3-双加氧酶表达，吲哚胺-2,3-双加氧酶可以通过分解色氨酸抑制T淋巴细胞增殖[34-35]。CTLA4还能通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白依赖性激酶4/6和核因子κB来抑制T淋巴细胞的增殖及活性[35-37]。有研究提出，CTLA4不仅可以通过细胞内部的机制抑制T淋巴细胞功能，还可以通过改变T淋巴细胞与APC之间的作用时间发挥免疫抑制效应。CTLA4受体被激活后直接逆转了由TCR受体产生的“停止信号”，抑制了APC与T淋巴细胞之间的稳定性免疫复合物形成，阻止了TCR黏附信号的传递，缩短T淋巴细胞与APC作用时间，从而降低细胞间的信号传递效率[38]。还有研究认为，CTLA4通过发出“走”的信号来提高T淋巴细胞的运动性，减少与APC之间的接触[39]。

与CTLA4不同，在T淋巴细胞与APC相互作用期间，PD-1在细胞突触上广泛表达[40]。PD-1与配体结合后可以募集胞内的酪氨酸磷酸酶将PD-1的胞内尾端磷酸化，并且PD-1的胞内结构域免疫受体氨基酸抑制序列和免疫受体氨基酸开关序列可以与含有Src同源-2(Src homology 2,SH2)结构的SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2)酪氨酸磷酸酶结合，从而传递抑制信号抑制T淋巴细胞活性[41]。然而，目前关于PD-1抑制T淋巴细胞的具体作用机制尚未完全明确。传统观点认为PD-1主要通过靶向抑制TCR信号激活发挥免疫抑制作用[42]。PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP2后降低了TCR内在信号转导亚基CD3 ζ和Zeta链相关蛋白激酶70的磷酸化，从而减弱了TCR信号的活化[42]。然而有研究发现，PD-1介导的抑制信号中的主要靶目标是T淋巴细胞的共刺激受体CD28,通过对比CD28与CD3 ζ和Zeta链相关蛋白激酶70以及TCR下游适配器的T细胞激活接头和含有分子量为76 000白细胞蛋白的SH2结构域后发现，CD28是PD-1-SHP2最敏感的靶标[43]。Mizuno等[44]的研究则认为PD-1可以直接抑制TCR信号，而CD28的共刺激信号则减弱了PD-1对TCR信号的抑制作用。此外，Mathieu等[45]发现，PD-1/PD-L1可以通过激活Notch信号通路诱导Treg细胞增殖。PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP2后抑制Th1细胞中的信号转导及转录激活因子激活，促进Th1细胞转化为Treg细胞，并通过灭活天冬酰胺基内肽酶维持Treg细胞的免疫抑制功能[46-48]。

3 免疫检查点与AP的相关研究

20世纪90年代，研究人员培养了CTLA4基因缺乏的小鼠15 d后，发现小鼠体内出现胰腺炎、心肌炎的多器官损害现象，其中以胰腺炎的表现最为严重[12]。此外，近年在使用Ipilimumab(抗CTLA4相关免疫抑制剂)和Nivolumab(抗PD-1相关免疫抑制剂)等免疫检查点相关抑制剂的临床治疗过程中，患者出现了胰腺炎等并发症[49-51]。这些研究可能提示，在失去共抑制性免疫检查点受体的免疫监视后，免疫平衡状态被打破，大量的炎症细胞因子被激活并迁移至胰腺组织，通过释放大量的炎症因子和直接的细胞毒性作用导致局部以及全身的炎症损伤。

CTLA4和PD-1免疫检查点介导的免疫抑制反应与AP的发病机制密切相关。Zhulai等[52]研究发现AP患者外周血中Treg细胞的CTLA4表达水平较健康对照组明显升高。Pan等[7]研究AP患者发病期间感染性并发症与免疫检查点之间的联系发现，AP患者在发病后第1天和第3天表达PD-1的CD4+T淋巴细胞和表达PD-L1的CD14+单核细胞的百分比增加，尤其在并发感染时增加程度更显著。而且PD-1表达的增加与外周循环血中淋巴细胞数量减少以及血浆IL-10水平增加有关。此外，Chen等[53]进一步发现血清中游离的PD-L1水平与AP的感染性并发症密切相关，并发感染性并发症患者外周血中PD-L1水平明显升高，并与外周血中的淋巴细胞数量呈负相关，其联合血清游离PD-L1水平与淋巴细胞计数对预测AP患者的感染性并发症具有较高的准确性。这些研究均提示，AP发病期间的免疫抑制可能由免疫检查点介导。在并发感染性并发症时，这些过度激活的免疫抑制信号遏制了T淋巴细胞功能，导致T淋巴细胞对病原体的免疫识别及清除能力下降，进一步加重AP患者的感染性并发症。但关于免疫检查点在AP中的具体作用机制还有待进一步研究。

尽管目前关于AP与免疫检查点受体CTLA4和PD-1的研究尚处于起步阶段，但逐渐揭示了免疫抑制现象在AP中的作用。在AP的早期发展阶段，机体为了遏制过度激活的炎症反应，免疫细胞的CTLA4和PD-1等共抑制性免疫检查点被激活，释放抗炎因子发挥代偿性抗炎反应。AP的病情转归最终取决于炎症反应与抗炎反应之间的平衡。当抗炎反应足够强烈能够“中和”炎症反应时，患者病情可能好转。相反，抗炎反应无法抵抗过度激活的炎症反应时，患者病情加重，甚至出现多器官功能衰竭等全身性免疫损伤。然而，过度的抗炎反应又会使机体进入免疫抑制状态，甚至导致T淋巴细胞功能耗竭，增加机体易感性，并发后期的细菌感染。充分利用免疫检查点CTLA4和PD-1的免疫抑制通路在AP中的作用，可能为临床提供新的诊疗方案。

4 小 结

针对CTLA4和PD-1的AP治疗可能与肿瘤的治疗有所区别。因为在AP发展的不同阶段CTLA4和PD-1的免疫抑制作用可能扮演不同的角色。早期若能充分激活CTLA4和PD-1共抑制性免疫检查点受体，以遏制炎症细胞的过度激活，或许可以阻止局部的胰腺组织的炎症反应扩散至全身炎症反应，减少其他器官的炎症损伤。而在病程晚期，利用抗CTLA4和抗PD-1相关免疫抑制剂阻止过度发展的免疫抑制反应，提高T淋巴细胞等免疫细胞对细菌的免疫清除能力，可以降低后期感染性并发症的发生率。但在尚未完全了解免疫检查点在AP发病过程中的具体作用机制前，针对CTLA4和PD-1的AP治疗还处于理论阶段。因此，深入探讨免疫检查点在AP发病过程中的作用，并因此提出针对性的治疗方法具有重要的理论意义与实践价值，这也是今后AP基础与临床研究的方向。