重组人血管内皮抑制素注射液放疗增敏作用机制的研究进展

王思雨，张大昕

(哈尔滨医科大学附属第一医院肿瘤一科，哈尔滨 150001)

在肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中，新生血管为肿瘤生长输送氧气、提供养分。1971年，Folkman[1]首次提出血管生成的概念，并指出阻断肿瘤新生血管生成是遏制肿瘤发展和侵袭的有效策略。此后，抗血管生成药物被广泛应用于多种实体肿瘤中，血管靶向策略为抗肿瘤治疗带来新希望。内皮抑素是O′Reilly等[2]于1997年首次从鼠血管内皮瘤血清中发现并提取的一种内源性蛋白，具有显著的抗血管生成作用和广泛的抗肿瘤谱。而可溶性内皮抑素更具抗肿瘤活性，因此由我国自主研发的新一代抗血管生成药物重组人血管内皮抑制素注射液(商品名:恩度)应运而生，2005年美国食品药品管理局正式批准恩度作为复发和转移非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的一线用药[3]。目前，最新指南明确指出，在晚期NSCLC、转移性鼻咽癌以及恶性黑色素瘤中，恩度可作为推荐使用的药物[4-5]。但目前单用抗血管治疗尚无长期生存率的报道，因为抗血管生成只能阻断肿瘤发展的某条或某些通路，并不能杀灭肿瘤细胞。基于此，人们开始将血管靶向治疗与传统放化疗联合起来进行研究。1995年，Teicher等[6]最先发现了抗血管生成治疗对放疗能起到加强作用。恩度能够起到放疗增敏作用，且不会增加对正常组织的毒性。现就恩度放疗增敏作用机制的研究进展予以综述。

1 恩度的结构特点及抗肿瘤作用机制

1.1结构特点 内皮抑素是XVIII型胶原C端的一个20 000的片段，是最有效的内源性血管生成抑制因子之一，其一级结构中包含184个氨基酸，二级结构以β-折叠和环为主[2]。以往人们认为内皮抑素抗血管作用主要来自其中的锌结合位点，但近年来有研究通过对内皮抑素进行变体后发现N端的二硫键环可能才是其抗肿瘤活性的关键结构[7]。恩度是我国科学家研发的一种重组人血管内皮抑制素，在天然内皮抑素的母体基础上添加了9个氨基酸序列，使得内皮抑素的半衰期延长，稳定性提高，生物活性增强，由于其蛋白表达体系来源于大肠埃希菌，故解决了内皮抑素容易形成包含体的问题[8]。

1.2抗肿瘤作用机制

1.2.1作用于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/VEGF受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR) 机体对肿瘤新生血管的调控符合双向调节的普遍规律，是正性调控因子和(或)负性调控因子相互作用的复杂过程。VEGF家族是促进新生血管形成最重要的正性调控因子之一，在肿瘤血管生成的调控中起主导作用，恩度能够下调VEGF的表达水平并作用于VEGFR，使VEGF与血管内皮细胞的结合受阻，下调VEGF-VEGFR所介导的下游信号通路，进而抑制血管内皮细胞的活化、增殖与迁移[9]。

1.2.2作用于基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP) MMP是一个大家族，主要功能为降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的蛋白成分。在TME中，肿瘤细胞与基膜表面的受体结合后分泌MMP等降解酶，降解ECM，肿瘤侵袭的组织学屏障被破坏，使肿瘤细胞得以沿基质空隙和基底膜缺损向周围侵袭生长，而内皮抑素可以与MMP的前体结合形成稳定的复合物，阻止MMP活化，进而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭[10]。Xu等[11]在H22肝癌小鼠模型中证实，应用恩度可显著下调MMP-2和MMP-9水平，并使肿瘤微血管密度显著降低。

1.2.3作用于核仁素 肿瘤细胞与内皮细胞的表面有复杂、相互作用的网络，其中核仁素起重要作用，血管内皮细胞增殖与核仁素的磷酸化紧密相关[12]。内皮抑素可结合处于增殖状态的微血管内皮细胞表面的核仁素，并被其转运至细胞核内，抑制核仁素的磷酸化，从而抑制内皮细胞活化、增殖[13]。但由于核仁素只在血管内皮细胞上特异性表达，所以恩度对其他细胞(如平滑肌细胞、成纤维细胞)无作用[14]，因此安全性较高。

1.2.4诱导细胞凋亡 细胞凋亡是基因调控细胞的自主有序性死亡，是机体为维持内环境稳定而进行的程序化过程。Bcl-2家族是一个重要的凋亡调节蛋白家族，其低表达可促使细胞凋亡，而内皮抑素可以通过抑制Bcl-2的表达，诱导肿瘤血管内皮的凋亡，导致肿瘤新生血管的衰退[15]。也有研究认为，内皮抑素可与原肌球蛋白相互作用，破坏微丝的完整性，从而促进血管内皮细胞凋亡[16]。此外，有研究发现，内皮抑素不是血管特异性的，它可以直接作用于肿瘤细胞本身，抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[17]。

2 恩度的放疗增敏作用机制

2.1提供血管正常化时间窗 氧能促进活性氧类和自由基的产生，是已知的有效放射增敏剂。然而，缺氧在肿瘤中十分常见，在大多数实体瘤中，新形成的肿瘤微血管形态结构紊乱、基膜不完整，导致血流紊乱、淤滞，甚至出现反向流动、血管塌陷。这种异常的血管结构会导致血流量减少、血流灌注异质化，加重肿瘤内部缺氧。在缺氧的TME下，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和VEGF的表达均上调，诱导肿瘤新生血管生成，降低了放疗的敏感性；同时，放疗本身还可通过上调促血管生成因子(如VEGF、血小板衍生生长因子)和促存活因子(如Bcl-2、Bcl-xL)，诱导新生血管形成，并促进肿瘤细胞增殖，引起放疗抵抗[18-19]。这使得放疗与血管生成形成了一个不可避免的恶性循环。以往人们认为，抗肿瘤血管生成会加重肿瘤细胞缺氧，降低放疗的效果，但Jain[20]指出，血管生成抑制剂可以修剪肿瘤新生血管，使其短暂地“正常化”，并使其更有效地进行氧气和药物输送，从而提高常规疗法的疗效。血管正常化给放疗提供了一个窗口期，在这个窗口期内肿瘤微血管的功能与正常血管接近，缺氧细胞比例降低，肿瘤细胞对放射线敏感性提高[21]。另有学者研究发现，恶性脑胶质瘤患者接受Cediranib(AZD2171)治疗后血管的正常化状态可能是可逆的[22]，提示时间窗的选择在联合治疗中至关重要。郝美丽等[23]通过对小鼠胃癌移植瘤模型的研究，发现恩度治疗后肿瘤血管正常化的时间窗为第5～9天，且该时间窗内微血管密度降低，Ⅳ型胶原表达增多，HIF-1α表达减少，可见恩度在该时间窗内可使肿瘤微血管减少、基膜完整、周细胞覆盖率增加、TME的缺氧状态得以改善，从而打破放疗与血管生成的不良循环，起到放疗增敏效应。蒋晓东[24]在肺癌患者使用恩度治疗后第1、5、10天进行缺氧显像和CT灌注成像，结果发现，血流量呈现先升高后降低的“倒U型”趋势，并在第5天达到峰值。杨振东[25]在临床试验中应用超声造影技术评价了恩度诱导鼻咽癌患者肿瘤血管正常化效应，结果显示，出现血管正常化波形的时间窗约为应用恩度后5 d内，与动物实验的正常化时间窗基本吻合。

2.2下调促血管生成因子水平 VEGF、HIF-1α是已知的可由放疗诱导、引起放疗抵抗的促血管生成因子。HIF-1α是一种在缺氧条件下稳定表达的核转录因子，激活后可转录下游的多种基因，使组织、细胞适应缺氧环境。在肿瘤组织中，HIF-1α可维持肿瘤细胞及内皮在缺氧环境中内环境的稳定，使其免受放疗损伤，加速肿瘤新生血管形成，降低肿瘤组织对射线的敏感性[12]，而抑制VEGF、HIF-1α可提高放疗的疗效。刘亮等[26]的体外研究表明，恩度能增强VEGFR-2信使RNA高表达的NSCLC细胞系Calu-1细胞的放射敏感性，推测其作用机制可能为恩度抑制了VEGFR-2的表达，通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B与促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶两条非缺氧途径下调HIF-1α的表达，从而增强细胞的放射敏感性。杨晓军等[27]在一项针对Ⅲa期肺癌患者的研究中，通过对肿瘤组织进行基因检测，发现高表达VEGFR-1和VEGFR-2的患者在应用恩度后复发转移率降低，提示VEGFR的表达水平可能是恩度辅助治疗潜在的疗效预测因子。另有研究显示，恩度能够降低小鼠肝癌组织中VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9以及白细胞介素-17的水平[11]，而VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9以及白细胞介素-17等可以不同的方式参与细胞增殖、转移，刺激新生血管形成。这个过程是否与放疗诱导有关目前尚无定论，可能是恩度联合放疗增敏的机制之一，有待于进一步研究。

2.3使细胞周期阻滞于放疗敏感期 细胞周期进程为：DNA合成前期(G1期)→DNA合成期(S期)→DNA合成后期(G2期)→分裂期(M期)。处于不同细胞周期时相的肿瘤细胞对放射线的敏感性存在差异，一般认为，G2/M期的细胞对放疗最为敏感，G1期次之，S期敏感性最低[28]。肿瘤细胞在缺氧的TME中G2/M期时间显著缩短，故肿瘤细胞表现出对放疗的抗拒[29]。因此，如果可以调整肿瘤组织中细胞所处的细胞周期状态，使其同步化于对射线敏感的时相，就能够增加细胞的放疗敏感性。Zhang等[30]应用流式细胞术评价了应用恩度对人肺癌A549细胞的作用，结果发现，给药后处于G2/M期、S期的细胞增加，且以G2/M期增加为主，由此推测，恩度可能是通过使细胞阻滞于G2/M期，增强了A549肺癌细胞的放射敏感性。Liu等[31]进行的食管癌细胞Eca109体外实验结果表明，恩度与放疗联合组G2/M期、S期细胞的百分率较对照组和放疗组显著降低，而G0/G1期细胞百分率显著升高，放疗组与联合组的细胞凋亡率均高于对照组，且联合组高于放疗组，故认为恩度可能通过细胞周期阻滞诱导细胞凋亡的方式增加放疗的敏感性。此外，处于对放疗不敏感时相的肿瘤细胞的存活是放疗后肿瘤复发的根源，恩度通过非特异性抑制细胞增殖，作用于处于S期的肿瘤细胞，从而达到减轻放疗抵抗、抑制肿瘤生长的目的[32]。

2.4诱导内皮细胞和肿瘤细胞凋亡 Folkman[14]在关于恶性肿瘤的“二室模型”中提出，内皮细胞和肿瘤细胞两种群体可相互永久性诱导各自与肿瘤恶性程度相关的表型表达，使肿瘤细胞持续扩增，恶性程度也随之增加。放疗可引起DNA单链或双链断裂，通过使细胞停滞在特定细胞周期内(或细胞崩解)起到杀伤内皮细胞和肿瘤细胞作用；而放疗引起细胞DNA单双链断裂后，细胞会激活细胞周期检查点使细胞发生细胞周期停滞，为DNA的修复提供时间[33]。恩度可能通过抑制细胞DNA损伤修复、诱导细胞凋亡来协同放疗杀伤，具体机制很可能是多通路、多靶点的，有待进一步研究明确。蒋晓东[24]通过对A549肺腺癌裸鼠移植瘤的研究发现，恩度与放疗联合组的肿瘤细胞凋亡增多，肿瘤退缩早，较单独治疗组具有更好的肿瘤控制。Meng等[34]的研究表明，恩度可在多种NSCLC细胞中抑制高迁移率族蛋白B1的表达与释放，从而抑制肿瘤细胞的增殖。Yan等[35]研究发现，内皮抑素还可抑制DNA-蛋白激酶C，影响其磷酸化，导致DNA损伤累积，从而诱导多种肿瘤细胞的凋亡；体内试验发现，恩度与人凋亡相关新基因DESI2(desumoylating isopeptidase 2)联用治疗较单一治疗可更显著地抑制肿瘤生长，并有效延长荷瘤小鼠的存活时间。

2.5改善TME TME是一个时刻发生动态变化的复杂环境，其免疫状态与肿瘤的发展密切相关。研究表明，恩度可以显著降低肿瘤组织中骨髓来源抑制性细胞、M2型肿瘤相关巨噬细胞的数量，增加成熟树突状细胞和M1型、M2型肿瘤相关巨噬细胞数量，并可使更多的CD8+T淋巴细胞浸润到肿瘤组织中，使肿瘤内部抑制免疫应答的微环境逆转为促进免疫应答的微环境[36]。程序性死亡受体1是近年来发现的一种重要的免疫抑制分子，能够抑制T细胞炎症活动，促进免疫逃逸。Wu等[37]研究表明，抗程序性死亡受体1联合恩度能够显著抑制Lewis肺癌小鼠模型中的肿瘤生长，这种协同效应可导致VEGF表达显著下调、白细胞介素-17和转化生长因子-β1水平降低、骨髓来源抑制性细胞积聚减少以及CD8+T淋巴细胞抑制状态逆转，而肿瘤细胞凋亡和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白介导的自噬均上调。肿瘤血管正常化与免疫重编程之间相互调节形成一个加强环路，诱导强效而持久的抗肿瘤免疫[38]。放疗除了直接杀伤细胞外，还具有促进局部和全身控制实体肿瘤的潜力，是一种有效的免疫调节剂。放疗可将细胞毒性T淋巴细胞募集到TME中，从而调节免疫反应，改变TME的免疫抑制状态[39]，这与恩度对TME的影响类似，因此推测恩度对TME的逆转可能也是其放疗增敏作用的机制之一。抗血管生成治疗与放疗、免疫治疗联合是目前最有前景的研究方向之一，期待进一步的机制揭示为治疗恶性肿瘤提供新策略。

3 小 结

恩度对放疗的增敏作用很可能是一个多通路、多步骤、多靶点的复杂过程。尽管近年来抗血管生成与放疗联合应用的研究成果日渐增多，但大多仍处于临床前期和临床研究阶段，且缺乏高级别的循证医学证据。2018年的一项临床研究显示，持续输注恩度联合放化疗虽然能获得更好的总生存期，但并不能延长中位无进展生存期[40]。未来，应进一步明确联合治疗的最佳时序与时机、选择给药的最佳途径[41]、寻找可用于临床的血管正常化生物学标志物、建立更为可靠的疗效预测手段和不良反应评价体系以及明确可能受益的病种、优势人群等。