LncRNA在固有免疫应答中的调控作用

宁晓县 申元英 郭 乐

固有免疫主要由组织屏障、免疫细胞和免疫分子构成，是宿主消除入侵病原体的首道防线。免疫细胞表面具有模式识别受体(PRRs)，如Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)、维甲酸诱导基因I样受体家族[retinoic-acid-inducible gene I(RIG-I)-like receptors, RLRs]和核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors, NLRs]，能识别结合病原体及其产物或体内凋亡、畸变等细胞表面相关配体，发挥抗感染、抗肿瘤、免疫调节作用，并参与适应性免疫应答的启动、效应和调节。研究表明，人类基因组序列中能够编码蛋白质的核酸序列只有不到2%，其余大部分序列只能被转录为非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)，不具有编码蛋白质的功能，这些ncRNA曾经一度被认为是没有功能的“垃圾序列”和“转录噪声”而未曾受到关注和重视。在20世纪90年代早期，具有基因特异性调控作用的LncRNA被发现，随着研究的发展，LncRNA在基因的转录、翻译等重要生命过程中的作用逐渐被探究[1]。

一、LncRNA概述

LncRNA是一大类非蛋白编码转录本，长度超过200个核苷酸，位于细胞核或细胞质内，大部分LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录形成的，拥有3′ployA尾巴和5′帽子结构，由于缺少完整开放阅读框，不能编码蛋白质，而是直接作为RNA发挥作用。LncRNA根据蛋白质编码基因的位置可以分为以下5种类型：①正义(sense)LncRNA；②反义(antisense)LncRNA；③内含子(intronic)LncRNA；④长基因间非编码RNA(long intergenic non-coding RNAs, LincRNA)；⑤双向LncRNA。研究表明，LncRNA可以参与多种细胞过程：染色质重塑、转录和翻译调控、mRNA降解、剪接调控、细胞周期调控和固有免疫等[2]。随着高通量测序技术的迅速发展和应用，发现LncRNA可以调控基因表达，主要通过调节细胞免疫、表观遗传、基因转录水平以及转录后水平发挥作用，进而参与多种疾病的发生机制，并在固有免疫应答中发挥重要的作用[3]。2009年，Guttman等提出LncRNA可能调节固有免疫应答的观点，此后大量研究也发现许多(如LncRNA Lethe、LncRNA PACER、LncRNA THRIL和LncRNA NEAT1等)与固有免疫相关的LncRNA[4]。

二、LncRNA对TLRs信号通路的调控作用

TLRs是重要的模式识别受体，能够识别来自病毒、细菌、真菌和寄生虫原生动物的PAMPs，诱导产生炎性细胞因子或Ⅰ/Ⅲ型干扰素(interferon, IFN)，抵抗病原微生物感染，启动固有免疫。目前，在哺乳动物中已鉴定出13种TLR，其中TLR1～TLR9在小鼠和人体内均表达，TLR10仅存在于人体内，而TLR11～TLR13仅在小鼠体内被发现。TLR2、TLR4、TLR5位于细胞膜表面，分别识别脂蛋白、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)以及鞭毛蛋白；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于细胞内囊泡，参与识别微生物的核酸成分，分别识别病毒双链核糖核酸(dsRNA)、单链核糖核酸(ssRNA)、ssRNA和CpG寡核苷酸(CpG DNA)。LncRNA是TLRs激活调节剂之一，可以靶向TLRs信号通路上的许多分子，如转录因子NF-κB、接头蛋白MYD88、细胞因子IL-6、CCL2、CXCL10等。

1.LncRNA对TLR2、TLR4、TLR5信号通路的调控作用：TLR2能识别PAMPs及某些内源性配体，引发信号转导并导致炎性介质的释放，越来越多的证据表明，LncRNA参与调节TLR2介导的免疫反应。如LncRNA-Cox2是一种广泛的调控元件，能激活和抑制不同种类免疫基因。在TLR2配体Pam3CSK4的刺激下，巨噬细胞(macrophages, Mφ)中LncRNA-Cox2过度表达，通过与hnRNP-A/B和hnRNP-A2/B1形成复合物以抑制炎症靶基因转录，导致促炎基因的表达增加[3]。此外，有实验通过利用反义寡核苷酸沉默THP-1细胞中LncRNA NEAT1的表达，发现TLR2信号活化下游诱导的细胞因子(如IL-6、CCL2、CXCL10等)受到抑制，从而阻止炎症发生[5]。然而，LncRNA-DYNLRB2-2对TLR2的表达起负调控作用，在Mφ中，LncRNA-DYNLRB2-2表达上调，通过降低TLR2的表达，促进胆固醇流出，最终减轻炎性反应[6]。由此可见，LncRNA可以作为Mφ中的TLR2信号通路的调控因子参与疾病的进展。

TLR4是LPS刺激下革兰阴性菌的主要PRRs，研究发现,LncRNA可以靶向TLR4，调控炎性反应。LncRNA-EPS是一种免疫调节LncRNA，在Mφ中受到精确调控，控制IRGs(免疫反应基因)的表达，其通过TLR4诱导位于其3′末端CANACA基序与异质核核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L, hnRNPL)相互作用，控制核小体的定位并抑制免疫基因转录，从而抑制炎性反应[7]。Tao等[8]通过采集感染呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)的患者的鼻咽样本并结合体外细胞实验发现，LncRNA MEG3可以抑制TLR4依赖的p38 MAPK和NF-κB信号通路，保护人气道上皮细胞免受RSV感染，从而抑制炎性反应。LncRNA HIX003209是另一个调节TLR4的LncRNA，在类风湿关节炎中与疾病活动呈正相关，但不直接与TLR2、TLR4及下游蛋白NF-κB结合，而是通过特异性识别miR-6089，发挥内源竞争RNA(ceRNA)的作用，间接促进Mφ中TLR4的表达和下游信号分子NF-κB的激活，从而增强炎性反应[9]。

TLR5是最常触发的模式识别受体，多种LncRNA被证明间接参与TLR5信号通路的调控。其中，LncRNA MALAT1在调节炎症和固有免疫中具有潜在作用，在烧伤和烧伤后感染败血症的动物模型中，观察到MALAT1表达明显增加，miR-214表达降低，其靶基因TLR5表达与MALAT1的结果相同，而shMALAT1处理会逆转这些表达，提示MALAT1可以间接调控TLR5，在败血症中发挥关键作用[10]。研究表明，在神经性疼痛中，XIST/miR-154-5p/TLR5是一个新的治疗靶点，LncRNA XIST可以通过降低miR-154-5p的产生来显著上调TLR5的表达，从而促进神经病理性疼痛的发生和进展[11]。此外，在体内小鼠模型和体外癫痫细胞模型中，转录因子SP1可以激活LncRNA SNHG1的转录活性，被激活的SNHG1负调控miR-154-5p，靶向TLR5发挥功能，促进癫痫的发展[12]。

2.LncRNA对TLR3、TLR7、TLR8、TLR9信号通路的调控作用：TLR3能特异性识别dsRNA，通过激活NF-κB或干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)，从而发挥免疫作用。有研究发现，LncRNA CRNDE可以调节TLR3/NF-κB信号通路，通过激活TLR3信号通路，进一步激活NF-κB，释放IL-6、CCL5、CXCL9、TNFSF10等多种细胞因子，触发炎性反应，最终诱导脓毒症导致的肾损伤(kidney injury, KI)以及肿瘤的发生和发展[13,14]。

LncRNA MEG3参与Hunner型间质性膀胱炎(hunner-type interstitial cystitis, HIC)的发病机制，其水平的升高可以作为预测HIC风险升高的指标。通过采集HIC患者尿液样本进行实时聚合酶链反应和蛋白免疫印迹实验，证明LncRNA MEG3通过抑制miR-19a-3p，增高TLR7的表达，从而导致炎症损伤[15]。Li等[16]研究证实，外泌体LncRNA FMR1-AS1可以和TLR7结合，激活TLR7/NF-κB信号，促进c-Myc表达，诱导食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)细胞增殖、抗凋亡和侵袭能力，最终促进ESCC的发展。

TLR8被证实可以通过激活NF-κB，参与调节癌症。其中，LncRNA TLR8-AS1是卵巢癌中与癌症相关的成纤维细胞调控LncRNA，其作为一种致癌基因，通过稳定TLR8 mRNA上调TLR8，从而激活NF-κB信号通路，最终促进卵巢癌的进展[17]。

TLR9在免疫细胞中高表达。研究发现，Lnc-DC是树突状细胞(dendritic cell, DC)中的一组特定LncRNA，通过调控TLR9/STAT3信号通路，介导DC的生长、凋亡和免疫反应，敲低Lnc-DC，细胞凋亡增加，并负调节免疫应答[18]。此外，腺病毒感染可能触发TLR9-MYD88-STAT3信号，上调LncRNA-NEAT1的表达并激活STAT3，激活的STAT3进一步上调NEAT1，形成正反馈回路，促进原代胶质瘤细胞形成胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)，导致癌症的复发和转移[19]。

综上所述，多种LncRNA通过TLRs信号通路调控固有免疫，参与炎性反应的激活、消退以及肿瘤和其他许多疾病的发生、发展，为相关疾病的治疗提供新的方向。

三、LncRNA对NLRs信号通路的调控作用

NLR简称NOD受体，属于胞浆性PRR，是细胞内蛋白质，主要在炎性反应和宿主抵抗微生物病原体的防御中发挥关键功能。除NOD1和NOD2，其他NLR(如NLRP3)可以在炎性小体的组装以及活化过程中发挥作用，控制半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase-1)的活化，调节IL-1β和IL-18的产生，对于触发炎症及启动宿主防御反应极为重要[20]。NOD受体中的NLRP3和NLRC5在固有免疫应答中起着关键作用，LncRNA作为调节分子，可以调节NLRP3的激活以及其引起的细胞因子的产生，还可以作为ceRNA与miRNA相互作用，靶向调控NLRC5，从而在疾病的发生过程中发挥重要作用。

1.LncRNA对NLRP3信号通路的调控作用：NLRP3炎性小体是固有免疫的重要组分，在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用。研究表明，LncRNA可以调控NLRP3的表达，介导IL-1β和IL-18的分泌，从而参与调控疾病。其中，LncRNA-Cox2能够激活和抑制固有免疫细胞中的免疫基因，通过结合NF-κB的亚基p65，促进其核易位和转录，调节炎性小体传感器NLRP3和凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的表达。研究发现，敲除LncRNA-Cox2，会降低LPS刺激后的NLRP3和ASC，阻止caspase-1激活，导致IL-1β分泌减少，并使β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)裂解减弱，从而增强TRIF介导的自噬，限制炎症体的活性，减轻炎性反应[20]。研究证实，在乳腺炎中，Lnc XIST产生负反馈回路，阻止NF-κB通路激活，减少NLRP3的产生，抑制IL-1β和IL-18的分泌，促进细胞增殖，维持细胞活力，减缓细胞凋亡[21]。

2.LncRNA对NLRC5信号通路的调控作用：NLRC5是NLR蛋白家族中最大的蛋白分子，被确定为免疫反应的关键调节剂，在免疫应答调节和细胞因子中发挥着重要作用，并参与多种人类肿瘤的进展。在神经胶质瘤中，LncRNA SCAMP1表达上调，并作为致癌基因发挥作用，通过探究其机制发现LncRNA SCAMP1可以负调控miR-499a-5p的表达，增加转录因子LMX1A，转录激活NLRC5的表达，通过刺激Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤细胞的恶性进展[22]。实验发现，LncRNA XIST是一种新的乳腺癌预测因子，在乳腺癌组织和细胞中XIST显著上调，竞争性结合miR-125b-5p或miR-7/miR-92b，靶向抑制NLRC5，导致乳腺癌细胞恶性化[23,24]。

四、LncRNA对RLRs信号通路的调控作用

RLRs是一种重要的病原体识别受体，包括视黄酸诱导基因I(RIG-I)、黑素瘤分化相关因子5(melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)、遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2, LGP2)。其中RIG-I和MDA5通过共同的衔接子IPS-1信号驱动下游转录反应的激活，诱导IFN的产生，增加抗病毒和免疫调节基因的表达，控制病毒复制和传播，并引起细胞内的免疫应答[25，26]。

1.LncRNA对RIG-I信号通路的调控作用：RIG-I信号通路是抗病毒免疫反应中的新型负调控机制，通过使用水疱性口炎病毒感染进行研究，证实Lnc-MxA作为干扰素刺激基因，可以和IFN-β启动子形成RNA-DNA三链体，干扰IRF3和NF-κB与启动子的结合，负调控IFN-β的转录，抑制RIG-I介导的抗病毒免疫反应[27]。Lnc-Lsm3b是一种宿主来源、IFN诱导的长非编码RNA，可以维持免疫稳态，出现病毒感染时能与RIG-I特异性结合。在MφRAW264.7中研究其机制发现，Lnc-Lsm3b通过反馈抑制RIG-I激活，并阻止IFN的过量生产，控制自身免疫性炎性疾病[25]。

2.LncRNA对MDA5信号通路的调控作用：LncRNA ITPRIP-1是首个被发现参与MDA5激活的LncRNA，由IFN和病毒感染诱导。在病毒感染的免疫反应中，ITPRIP-1不通过RIG-I信号通路，而是通过促进MDA5对病毒RNA的识别和MDA5介导的IFN产生信号转导，增强MDA5介导的固有免疫反应[26]。目前，LncRNA参与MDA5信号通路调控的研究报道有限，还有待于进一步研究。

五、展 望

固有免疫是机体抗感染的第一道防线，可启动适应性免疫应答，通过PRRs调控免疫反应，以维持机体的稳态。多种LncRNA被证实可以通过调节靶基因的表达、调控固有免疫信号通路，对外界刺激做出快速应答。相对于miRNA以及编码蛋白的序列来说，LncRNA的研究还处于初期阶段，关于LncRNA对固有免疫受体的精确调控机制的研究还有待深入。随着对LncRNA领域的不断深入研究，其与固有免疫受体信号转导之间的关系以及机制将会逐步清晰明了，从而为相关疾病的治疗和预后提供新靶点。