牙本质和牙骨质的仿生修复与再生

2021-11-30王珏王倩吴佳李凌锋隋欣李美慧张骁高颖杨柳青刘志辉

口腔疾病防治 2021年6期

王珏，王倩，吴佳，李凌锋，隋欣，李美慧，张骁，高颖，杨柳青，刘志辉

吉林大学口腔医院修复科，吉林长春（130021）

牙体硬组织缺乏完善的自我修复能力［1］。在牙本质和牙骨质中，羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）可存在于胶原纤维外，也可存在于纤维内［2］。如何在胶原纤维存在的情况下，修复或再生出具有高度有序定向排列的HA 是牙本质和牙骨质修复和再生的难点。牙本质是人类牙齿的硬组织基础，约70%的牙本质由板状不规则HA 纳米晶组成，并存在少量的Na+、Mg2+和Zn2+等无机离子，并具有一定的再生能力［3］。牙骨质矿化度约为50%，其无机相为纳米HA 颗粒，并存在Na+、Mg2+和F⁃等无机离子，其中F⁃高于其他任何矿化组织［4］。牙骨质分为无细胞牙骨质和细胞牙骨质［5］。无细胞牙骨质包含Sharpey 纤维和纤维之间平行排列于牙根表面的固有胶原纤维，其生长是Sharpey 纤维逐渐矿化的过程，具有Sharpey 纤维的无细胞牙骨质是悬挂固定牙齿的重要功能结构［4，6］。

1 源于纤维矿化机制的仿生矿化体系

将矿物质重新引入胶原纤维并部分或全部恢复牙本质和牙骨质组织特性称为功能性再矿化［2］。胶原蛋白（collagen，COL）的间隙区域内存在带正、负电荷的氨基酸簇，形成了能协调Ca2+、PO43⁃的三维环境以提供成核位点。而牙本质基质蛋白（dental matrix protein 1，DMP1）、牙骨质蛋白1（ce⁃mentum protein 1，CEMP1）等非胶原蛋白（non⁃col⁃lagenous proteins，NCPs）可自组装并诱导无定型磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP）于COL 的成核位点定向矿化，使得HA 的C 轴与胶原纤维的C 轴一致［6⁃8］。

含有COL 的硬组织在脱矿时，纤维外矿物质先被去除；再矿化时则相反，适当条件下，ACP 先渗入纤维内进行矿化，达到一定程度的纤维内矿化后，纤维间会发生纤维外矿化。如果优先形成的是纤维外矿化，则将阻止纤维内矿化，从而导致较差的机械性能［2，9］。

在体外纤维内矿化过程中，非胶原蛋白、聚合物阳离子或阴离子在溶液中抑制磷酸钙成核，形成并稳定无定型磷酸钙［10］。无定型磷酸钙通过以下几种机制进入纤维内：①毛细作用扩散，但该假说中液态矿化前体的存在目前无法通过实验验证；②聚合物⁃矿物复合物与胶原蛋白特定部位的静电作用；③Gibbs⁃Donnan渗透平衡机制，聚电解质引起胶原蛋白的收缩和重新溶胀，收缩的胶原蛋白重新溶胀使无定型磷酸钙渗透到胶原蛋白间隙区域［7，9⁃11］。其中，静电作用可增强渗透，即二者共同为无定型磷酸钙进入纤维内提供了驱动力［7，10⁃11］。

1.1 牙本质

在矿化溶液中添加带电荷的聚合物已广泛应用于诱导纤维内矿化［12］。含有天冬氨酸（poly⁃as⁃partic acid，PASP）的聚合物诱导液体前体（polymer⁃induced liquid precursor，PILP）可渗透到由不同的酸（模拟由不同细菌产生）导致的脱矿牙本质中，且渗透深度基本相同，即PILP 可能可使得不同细菌导致的脱矿牙本质功能性再矿化［9］。由于脱矿后胶原网络仍然保留，因此再矿化过程重建了管间牙本质，又因管周牙本质不含胶原，故而再矿化后的牙本质小管变宽，但随着再矿化的进行，可能会出现脱矿牙本质表面沉淀，这会堵塞裸露表面附近的小管［9］。在修复充填治疗前，使用20 μL PILP 对脱矿牙本质湿润，溶液中的纳米无定型磷酸钙将快速渗透到脱矿牙本质中，用改性的玻璃离子将PILP 密封在病变内；2 周后，牙本质机械强度明显增强，尤其是脱矿最严重的外层区域，其弹性模量基本恢复［2］。但单独应用PILP 再矿化后的牙本质的弹性模量仅为天然牙本质的50%左右，这可能是因为PILP 虽诱导形成了大量的纤维内矿物质，但缺乏足够的纤维外矿物。为增加纤维外矿物质的形成，可以向体系中加入F⁃，F⁃可加速Ca2+沉积并促进前体相转化为晶体相［10，12］。含氟HA较HA 尺寸更大，故而在PILP 中添加F⁃可能可使前体相不易进入胶原蛋白，从而增加了纤维外矿物质的量［10］。将掺入F⁃的PILP 应用于牙本质再矿化时，再矿化效果与F⁃的浓度正相关，但在掺氟PILP中存在F⁃的浓度阈值，低于该阈值，增加氟含量可促进纤维内、外矿化；超过该阈值，可能使得溶液中没有足够的聚合物来稳定ACP，使其没有足够的时间进入纤维内，仅产生纤维外矿化［10，12］；未来可以通过仿照牙本质中无机成分改进PILP 中的无机成分来改善PILP 的仿生矿化后牙本质的理化特性。

1.2 牙骨质

牙骨质具有由与根表面平行的多层几微米厚的薄片组成的独特交替层状结构，含氟矿化胶原纤维在单层薄片中高度对齐，而薄片之间具有一定的角度。因此，构建仿生牙骨质的关键在于模仿交替层状结构的胶原纤维排列；Yang 等［12］通过生物刮除技术获得鼠肌腱脱细胞的胶原蛋白薄片，将其按照一定的角度堆叠以构建牙骨质样交替层状结构，并将其浸泡于由壳聚糖稳定的含氟的无定型磷酸钙溶液中以构建仿生牙骨质支架。当F⁃浓度为2.5 mM 时，其形态与人牙骨质高度相似。该仿生材料可促进成牙骨质细胞的分化、生长和黏附。但如何将其粘附到暴露的牙本质上仍待解决。为进一步模拟成牙骨质细胞的微环境，Yoo 等［13］向胶原蛋白支架中加入重组的人CEMP1，发现能促进细胞附着、分化，并能影响HA 的形态。Chen 等［1］用聚乙二醇［poly（ethylene glycol），PEG］稳定的无定型磷酸钙纳米粒子装载rhCEMP1进行控释，将其与由聚（ε⁃己内酯）［poly（ε⁃capro⁃lactone），PCL］、COL⁃1 一起经静电纺丝技术形成rhCEMP1/ACP/PCL/COL 多相支架。无定型磷酸钙既保护了半衰期短的CEMP1，又参与了生物矿化的过程，该支架能抑制牙周膜干细胞的增殖，并促进其向成牙骨质细胞分化，并在骨缺损处形成了牙骨质样组织。

2 以HA 为主要成分的仿生矿化体系

2.1 牙本质

HA 可以促进成牙本质分化，纳米HA 可阻塞原本开放的牙本质小管，并促进脱矿的牙本质再矿化［14］。Zhang 等［15］将载有牙髓干细胞的HA/丝素蛋白支架与牙齿碎片一起植入裸鼠的皮下，发现该支架可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，并形成非典型的管状牙本质，但不具有特殊结构或性质的HA 本身难以修复或再生出牙本质小管样结构。Panseri 等［16］以掺镁的HA 和明胶通过冷冻干燥与藻酸盐交联获得的具有类似牙本质小管结构的定向微管3D 支架，有助于细胞黏附、定植，掺入Mg2+更好地模仿了天然牙本质组织的化学组成，且Mg2+会阻碍HA 的过度结晶，而明胶则能稳定Ca2+并引发HA 成核。

脱矿牙本质（demineralized dentin matrix，DDM）因其可缓慢释放胶原蛋白和多种非胶原蛋白的独特优点被应用于仿生矿化。DDM 含有HA，并保留了牙本质小管样结构和功能，其管间和管周牙本质的纤维变得疏松，黏附于其上的各种生物因子可通过该通道持续释放［17］。体外实验证明，DDM可增加牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的黏附、迁移和诱导分化的能力［17⁃18］。体内实验中，载有DPSCs 的DDM 中形成了典型的牙本质结构，且能在其中检测到成牙本质细胞特异性标志物的mRNA 表达［17］。

2.2 牙骨质

用静电纺丝技术将HA 与醋酸纤维素物理结合获得薄层牙骨质样支架，其磷灰石相结晶度约为50%，并具有无序结构和低孔隙度［5］。另外在固化后的树脂表面形成具有板状结构的HA 涂层有可能在恰当的咬合负载下通过牙周膜样组织的再生促进牙周组织重建，并且未来可以考虑通过在涂层中加入锌等元素来改善其生物学特性［19］。具有微米和纳米级别的棒状杂化表面结构的HA（mi⁃cro⁃nano⁃hybrid structured hydroxyapatite，mnHA）较表面平坦内部致密的HA 相比，更能促进牙周膜干细胞细胞黏附、增殖甚至通过Wnt 信号通路促进成骨/成牙骨质相关标志物的表达，因此具有这样杂化表面结构的HA 可以作为牙骨质再生的支架材料［20］。此外，有学者将无定型磷酸钙与结晶磷酸钙交替组装，并在最外层包裹BMP⁃2，用于牙周缺损模型中，发现再生出较其他实验组更多的牙骨质，在合成HA 中加入生物活性因子可进一步提高HA 的再生潜能［21］。但上述方法均未形成含有胶原纤维的结构，故而难以实现牙骨质的功能。

煅烧牛骨羟基磷灰石（bovine hydroxyapatite，BHA）是一种天然的多孔矿物质，其主要成分之一为HA，其可被宿主组织部分代替［22］。将BHA 单独植入牙周缺损模型中时会出现不可吸收的BHA 颗粒从而干扰牙骨质的修复，故而向BHA 中加入软性的聚合物（例如壳聚糖），二者可能通过静电作用相互结合，增加材料的可吸收性，同时聚合物也可抑制成核、稳定无定型磷酸钙，从而更好地矿化。壳聚糖（chitosan，CS）/BHA 支架具有多孔结构，将其用于牙周缺损模型中可形成细胞混合纤维的牙骨质［23］。

目前再生牙骨质的策略常会得到不必要的细胞化牙骨质，并且新形成的牙骨质中缺乏有序排列的胶原纤维，即无法获得功能性的再生牙骨质［5］。另外，牙骨质再生与牙周膜、牙槽骨的再生密不可分，因此在探索牙骨质再生时应同时关注牙周膜和牙槽骨生理形成和再生［5，21⁃22］。迄今为止，牙骨质再生的方法研究仍处于起步阶段。

3 天然材料和合成材料的应用前景

虽然聚合物诱导液体前体（PILP）已能较好形成纤维内矿化，但其不具有天然牙本质、牙骨质中胶原指导离子成核、调节晶体大小及性状、促进定向排列的立体化学特征以及缺乏胶原结合大分子和胶原间的交联，胶原交联后胶原分子间的间距增加，可使无定型磷酸钙更易扩散进入胶原，从而促进纤维内矿化［7］。且合成体系中缺乏了天然体系中与胶原蛋白起协同作用的非胶原蛋白，以及非胶原蛋白对细胞的生物活性。

就对细胞行为和功能的影响而言，天然生物材料较合成支架更适合体内的牙本质形成［17］。但DDM 仍存在一些问题。①盐酸、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）酸蚀、超声处理酸蚀是常见的DDM 处理方式，但不同的处理方式可能会影响DDM 的性能；例如有学者认为10%EDTA 可通过释放牙本质基质生物活性成分来影响与牙本质修复和再生有关的细胞事件［18］；又如经乳酸和乙酸酸蚀后的牙本质的弹性模量和硬度也不同［9］，故而，未来需确认最佳的DDM 处理方式。②随着酸蚀时间的延长，脱矿牙本质显示出不断降低的硬度和密度，过长时间的脱矿将导致纤维内脱矿从而可能导致无效的支架［18］，因此需寻找最佳的脱矿时间，有研究显示用盐酸酸蚀6 h后的牙本质为适合用于硬组织再生的半刚性生物材料［24］。③DDM 中胶原蛋白和非胶原蛋白在酸蚀过程中降解，所产生的裂解物可被其内源性基质金属蛋白酶降解，从而降低了DDM 促进矿化的能力和生物活性［9］。有研究发现，髓腔周围的继发牙本质和管间牙本质富含Zn2+，且Zn2+可抑制牙本质基质中的基质金属蛋白酶和组织蛋白酶的活性［4，25］。因此，未来可探索如何使用Zn2+稳定DDM中的生物因子。

BHA 是牛股骨经过烧结后形成的以HA 为主要成分的矿物支架［22，26］，将BHA 应用于牙体硬组织再生时仍存在一些问题。①BHA 与人类牙体硬组织之间存在化学成分及HA 晶体大小上的差异，并且异种移植物具有疾病传播和免疫排斥的潜在风险［27⁃28］。②不同的烧结温度和时间将影响BHA的理化性质：随着温度升高，HA 的密度和硬度增加；低温（130 ℃）比高温（1 200 ℃）烧结的HA 具有更大的表面积和更小的晶体尺寸，这可能对再吸收率有重要影响［29］。即BHA 适宜的烧结温度和时间还应进一步探索。

与BHA 相比，合成HA 因其低免疫原性不会导致免疫排斥，且价格便宜，并且可通过定制形状、改变细胞分化特性和改善机械化学特性，尤其是强度、孔的特性和降解率，使之适合预期应用［20］。且纳米HA 可发挥以下作用：①纳米粒径的HA 可阻塞开放的牙本质小管［30］；②可直接在硬组织表面释放Ca2+和PO43+使其达到局部饱和状态从而再矿化［30⁃31］；③使得细胞的接触面积随之增大，使细胞的伪足延伸铺展从而增强了细胞功能［20］；④可能通过激活生长因子促进其增殖［32］。但合成HA中缺乏牙体硬组织的生长代谢中至关重要的微量素。其中Mg2+可能会抑制HA 晶体的生长，形成纳米级HA 晶体［16］；Zn2+的含量也与硬度高度相关［4］，F⁃增加牙齿的耐酸性［10］。此外单纯使用合成HA 作为再生硬组织的支架时仅为细胞生长提供了结构支持［22］。尽管将其与聚合物复合可提高HA 的再生潜能，但仍不如天然材料，这主要是由于合成HA 与聚合物组分之间缺乏天然硬组织中HA 与胶原蛋白之间的特殊空间位置关系、天然材料中可能含有的生物因子对细胞的生物学效应、以及天然材料的细胞黏附位点［16，33⁃34］。故而，未来应在合成HA 与聚合物的相互作用、在合成HA 中增加生物因子、通过化学修饰来提高细胞黏附力等方面来拓宽合成HA 的应用前景。