单细胞RNA 测序在贤移植排斥领域的应用及进展

熊旨雷，王振，付迎欣（天津市第一中心医院贤移植科，天津 300192）

在过去的半个世纪里，因为免疫抑制剂的研发以及免疫抑制方案的优化，临床器官移植无疑已取得了实质性的进展［1］。自从20 世纪80 年代钙调磷酸酶抑制剂环孢素及20 世纪90 年代新的小分子和生物制剂被成功引进移植免疫抑制领域以来，贤移植术后排斥反应的发生率从40%下降到了10%～15%［2］，然而慢性排斥反应导致的移植物远期存活率下降仍是一个亟待解决的难点［3］。相关研究表明，排斥反应的早期诊断和早期干预可以改善移植贤的预后［4］。

单细胞RNA 测序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术自2009 年发表以来得到了快速的发展［5］，不同于以往的测序技术，它能记录一个复杂有机体或组织中每个细胞的转录状况，为研究细胞间的异质性、描述不同细胞间的状态及发现新的细胞类型提供了新的思路［6］。这种方法可以用于了解移植物中正在进行的免疫反应，从而可能为排斥反应的诊断、治疗或预后提供新的思路和见解［1］。本篇综述结合近年来发表的相关文献，系统的阐述scRNA-seq 的技术发展以及其在移植贤排斥反应方面的应用及进展。

1 单细胞RNA 测序技术的起源和发展

人体不同类型的细胞虽然具有相同的遗传物质，但它们的大小、形态、表型、细胞内容物、代谢活动以及功能却不尽相同。这种细胞异质性很大程度上是由外部因素引起的，这些因素精确地调节细胞基因的表达和随后细胞的活化、增殖、分化，从而产生不同类型和不同功能状态的细胞［7］。在正常情况下，不同细胞发挥各自作用一起维持器官功能的稳定，往往其中一种或多种细胞的变化可能会导致疾病的发生，因此，在单细胞水平上对处于疾病状态的组织或器官进行全面的评估，可以为诊断、治疗和预后等方面提供有价值的信息［1］。

流式细胞术、原位杂交和免疫组织化学等传统的实验方法可以在细胞水平上提供部分信息，且这些方法也大大提升了我们对各种疾病发病机制的理解。然而，这些方法一方面只能同时获取有限的基因表达信息，另一方面，虽然微阵列和二代测序技术可以同时获取数千个基因表达的信息，但仅限于集合细胞的样本，从而忽略了样本中单个细胞的异质性。因此，这些方法在提供关于单细胞的转录信息方面都具有根本的局限性。

自Tang 等［5］在2009 年发表了第1 篇scRNAseq 论文以来，该项技术得到了不断发展，基于单个细胞水平的基因表达谱分析和表达谱的动态功能描述已经成为新的研究方法［8-9］，这一强大的技术已迅速被广泛用于神经科学、肿瘤和发育生物学等领域的研究［10-12］。直至最近几年，该方法才被用于移植免疫学的研究。

所有的scRNA-seq 技术都有如下几个共同的步骤：单细胞分离、细胞裂解和RNA 捕获、逆转录、扩增、文库生成、测序、数据分析［13］。 近年来，从单细胞悬液的制备、RNA 的扩增到复杂的cDNA文库的生成都获得了多项技术改进［14-17］。检测通量的增加提高了scRNA-seq 的效率，但同时也增加了实验设计和数据分析的复杂性。幸运的是，越来越多的利用R、Python 和 Matlab 等编程语言设计的统计和图形软件包可以简化数据分析过程，使大量的测序数据可视化，便于研究者分析［18］。

2 移植肾的排斥反应及传统基因测序

贤移植是终末期贤脏疾病或严重慢性贤脏疾病患者的首选治疗方法，与透析相比，它提高了患者的生活质量，具有更好的生存优势。根据组织病理学和免疫学特征，贤移植排斥反应可大致分为超急性排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应，除了以上典型类型之外还可表现为亚临床排斥反应、细胞和体液免疫反应同时存在的混合性排斥反应、以及急性排斥反应合并慢性排斥反应等［19］。目前，临床上诊断排斥反应的金标准为移植贤的穿刺活检，用光学显微镜、电子显微镜、间接免疫荧光以及有限的抗体对活检组织进行染色分析，然而，近几十年来的病理分析技术的进展十分有限，病理诊断结果也并非完全准确［20-21］。

传统的基因测序已被多项研究用来探究移植器官功能障碍或程序性活检组织中基因表达的模式［22-25］，通过比较某些同种异体移植病理中差异表达的基因来用于病理诊断，如急性细胞介导的排斥反应和抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）［26-29］。当然，这些大规模的转录组数据分析帮助我们更好地理解复杂的移植活检病理的同时也帮助临床做出更加准确的诊断。AMR 是远期移植贤丢失最常见的主要原因［30］，且病理科医生对于急性贤小球炎等关键组织学病理改变的诊断存在偏差［31］。研究数据表明，转录组分析比传统组织病理学诊断更好地预测了与AMR 诊断相关的不良结局，转录组分析的阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为50%和94%［29］。利用整个组织样本提取RNA 并使用微阵列技术进行转录组分析，已被用来临床诊断移植贤的排斥反应和纤维化［23，32］。同理，有研究使用外周血样本基因测序的方法来预测或诊断移植贤的排斥反应，Salomon团队应用微阵列（基因芯片）技术，使外周血基因表达谱可作为一种微创手段，在急性移植贤功能障碍的背景下准确预测排斥反应［33］。Roedder 等［34］利用贤移植急性排斥反应评估研究中的大队列，通过实时定量PCR 测定了一组预先确定的43 个基因的表达量，最终得到一个17-基因面板组（称为kSORT）能够在活检发现前3 个月预测急性排斥反应，但该方法不能区分T 细胞介导和抗体介导的排斥。然而，上述所有这些方法都只是测量了样本中的平均基因表达量，而忽略了细胞间表达的差异性，大量转录组分析可能错过或低估差异表达的基因，而这些低表达水平的基因可能在疾病的发生发展中起重要作用［18］。

3 单细胞RNA 测序在肾移植排斥领域的应用及进展

近年来，因scRNA-seq 技术对单细胞转录组数据的分析优势，使得该方法逐渐被应用于移植免疫学的研究。scRNA-seq 提供单个细胞水平的转录数据，通过数据可视化处理，能更加直观准确的了解细胞动态变化过程，如疾病进展、细胞状态的改变、细胞分化等。

目前，在贤移植领域，已发表的scRNA-seq 数据十分有限。Wu 等［35］发表了第1 篇关于移植贤混合排斥反应scRNA-seq 数据的文章，该研究本对1 例穿刺活检时所取的16 G 有核细胞进行测序，使用InDrops 进行RNA 扩增和文库生成，每个细胞的测序深度为50 000 个单位。共有4 487 个细胞通过了质量过滤器，平均每个细胞检测到来自827 个不同基因的1 481 个转录本，利用T 分布和随机近邻嵌入（tSNE）对16 个细胞簇进行无监督聚类分析，包括3 种管状细胞类型、3 种白细胞群、4 种淋巴细胞类型、3 种基质细胞类型、内皮细胞类型和循环细胞，这个数据集包含了所有的免疫细胞群，以及除了贤小球细胞的大多数供贤细胞类型。该研究得出了几个有趣的结论，首先，通过不同类型细胞（FCN1 阳性细胞和CD16 阳性细胞）间的差异基因表达鉴定出两种不同的单核细胞簇，并通过混合排斥组织样本的免疫组化染色得到了证实，正常贤脏染色稀疏或缺失，AMR 活检组织染色中等。其次，亚聚类分析定义了以下3 种不同的内皮细胞类型：静息型、血管生成型和活化型。本文还证实了内皮细胞在AMR 中的重要性。从微阵列研究中发现的大多数与AMR 相关的高表达基因在内皮细胞中唯一表达，然而，在微阵列研究中被描述为内皮相关的基因大多在这个单细胞数据集中的非内皮细胞中表达，也就是说，既往的研究只是根据体外对人内皮细胞的基因表达的研究，推测微阵列研究中表达的基因来自于内皮细胞［36-37］。这突出了基于微阵列的方法在移植物病理研究中的一个主要局限性。当然，这篇文章的局限性是在单一的移植贤活检的基础上进行的，这些发现仍有待其他活检和其他研究来证实。

近来，Liu 等［38］利用10×Genomics 技术测得2 例经传统病理证实的慢性移植贤排斥反应（chronic kidney transplant rejection，CKTR）组织的scRNAseq 数据，并与GEO 数据库中3 个健康成人贤脏的scRNA-seq 数据进行比较研究。通过使用无监督聚类分析确定了15 种不同的细胞类型，包括主要免疫细胞、贤细胞和少数几种基质细胞。并通过进一步比较各细胞亚群信号通路的独特特征，发现了与CKTR 不同功能相关的细胞亚型。对CKTR 生物学的研究提供了更深入的见解，将有助于CKTR 的诊断和治疗的研究。Malone 等［39］利用外显子序列中的单核苷酸变异体（single nucleotide variants，SNVs）的DNA 测序结合scRNA-seq 对5 个移植贤穿刺标本进行测序研究，探究在AMR 及非排斥反应的贤穿标本中供/受体来源的白细胞的持久性和转录特性。Dangi 等［40］在小鼠贤移植模型的基础上，利用scRNA-seq 分析出高表达Alx 的骨髓细胞可促进供体特异性T 细胞的增殖和分化，并通过组织学证实与移植贤早期炎症增强相关，为贤移植排斥反应的治疗提供了新的潜在治疗靶点。

尽管传统测序技术提升了我们对排斥反应的研究深度和理解力，但这些方法仅仅只描述了活检样本中表达基因的“平均值”，那些在排斥反应中必然发生的细微病理差异可能无法被分辨，例如，AMR 的发生可伴或者不伴有C4d 沉积、存在DSA的情况下并不一定会发生排斥反应等临床现象需要细微的分子和细胞差异来解释。因为活检样本包含了从免疫细胞到贤细胞的多种细胞类型，传统的测序方法也同时缺乏分辨既往忽略的在排斥反应中起作用的细胞类型甚至是新的细胞类型的能力［21］。而scRNA-seq 能从单细胞水平获得组织病理的转录信息，能弥补传统测序的不足。

4 单细胞RNA 测序在肾移植排斥反应领域现存挑战及潜在应用价值

scRNA-seq 虽然有诸多优点，但其同时存在诸多技术限制。由于单个细胞含有极少量的RNA，在需要足够量的样本细胞的同时，生物和技术干扰在这种高度敏感的技术中是很难避免的［1］。此外，由于只有5%～50%的mRNA 可以被逆转录，通过该技术获得的数据只能代表单个细胞的部分生物学过程［41］。制备单细胞悬液的过程对数据质量的影响至关重要，而实体器官单细胞悬液的制备是一大挑战，在组织加工过程中温度偏高时容易产生应激反应基因［42］，而这些转录信息不是被检查细胞固有的，尽管这些数据可以通过生物信息学分析小心地去除，但在数据分析时也应保持警惕，数据分析方法目前仍需要进一步优化和发展。最后，尽管scRNA-seq目前测序成本已经大幅下降，但费用仍然昂贵。

5 展 望

应用scRNA-seq 对移植贤病理的单细胞分析有可能大大提高我们对导致排斥反应的相关机制的理解，特别是解释AMR 的细微病理变化以及不同患者对抗排斥治疗反应的巨大差异。scRNA-seq 将有助于更好地了解排斥反应中相关免疫细胞和驱动同种免疫反应的途径。scRNA-seq 同时具备发现新的生物标志物的潜力（贤穿标本、血液、尿液等），同时，scRNA-seq 可以识别同种异体移植的病理特异性细胞状态的标记物，有望帮助临床病理区分排斥反应类型［18］。此外，新的免疫细胞治疗靶点可能会增加我们目前有限的排斥反应治疗的手段。