动静脉血循环肿瘤细胞检测在肺癌诊治中的意义及应用

梁卫娟 厉为良 高鹏帅 王亚旭

浙江大学明州医院呼吸疾病诊疗中心，宁波 315000

肺癌已经成为当前主要的公共卫生问题之一。根据郑荣寿等[1]统计分析，2015年我国男性肺癌新发病例52万，发病率73.90%(1/10万)，居所有肿瘤首位，女性肺癌新发病例26.7万，发病率39.78%(1/10万)，居第二位；按死亡人数顺位排序，2015年我国肺癌死亡人数约为63.1万例，病死率为45.87%(1/10万)居于我国恶性肿瘤死亡第1位。目前，尽管在癌症治疗方面取得了飞快进展，但肺癌的总体5年生存率仍不到20%[2]。大多数肺癌患者确诊时已处于晚期，导致了高病死率。CTCs检测是一种新兴的液体活检技术，在肿瘤的早期诊断、个体化治疗等方面有较广泛的应用，本文就CTCs简要介绍、检测技术、在肺癌中的应用及其在动静脉血中的差异等方面作如下综述。

1 简述CTCs及检测

1.1 CTCs介绍 早在1869，澳大利亚学者Ashworth在转移性癌症患者血液中发现一种与原发肿瘤细胞基本相似的细胞，并提出了循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念[3]。CTCs来源于原发实体肿瘤或转移灶，其主动或被动获得脱离基底膜的能力，并侵入及通过组织基质层，最后进入血管。肿瘤细胞脱落进入血循环后，大部分因机体的免疫监控或血流剪切、氧化应激、自身凋亡等原因在短期内死亡，只有极少部分活性高、转移潜性能强的CTCs能够存活下来，进而在远处靶器官中定植形成转移灶[4]。CTCs是局部疾病的大使，在血液中以单个或成群的方式运行，可在远处器官形成新的病变。此外，CTCs可能在转移部位仍处于休眠状态，并在稍后时间被激活，从而导致复发[5-6]。

循环肿瘤微栓子是数个细胞聚集成团进入血循环的团块。相比CTCs，它更能抵御“失巢凋亡”和免疫清除，有更强的生存优势，对细胞毒性药物的耐受性也相对更强[7]。恶性肿瘤细胞为了获得更强的侵袭和运动能力，会丢失一些上皮细胞的表型，并通过某些特定程序获得一些间质细胞的表型，即上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)。近年研究证据表明，多数恶性肿瘤脱离原发灶进行转移的过程中发生了EMT，发生EMT的癌细胞会上调多种蛋白质酶，降解细胞外基质，提高自身侵袭性[8]。CTCs中也有EMT发生，造成上皮细胞特异性分子[上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep CAM)、细胞角蛋白等]阴性表达，而间质细胞特异性分子标志物阳性率增加，这些细胞也具有更强的生存优势和转移潜能[9]。循环肿瘤微栓子主要通过EMT转化避免“失巢凋亡”，保持增殖能力。

CTCs与原发肿瘤或转移瘤分离、脱落，进入患者血液，是相对容易获得的肿瘤组织样本。对CTCs的探索和研究可以为临床提供大量的相关信息，反映疾病的实际、实时情况[10]。

1.2 CTCs检测技术 CTCs在血流中是非常罕见的，大约每1个CTC散落于数百万(106～107)个正常单核白细胞之中[10-11]。因此，为了能够研究和评估CTCs的数量和特征，其检测方法需要有足够强的敏感度及非常高的特异度。目前常用的肺癌CTCs检测方法有以下几种。

1.2.1 CellSearch技术 CellSearch技术已被美国食品药品监督管理局批准用于临床，也是多年来唯一被批准的。它依赖于EpCAM在靶细胞表面的表达[12]，该上皮标志物结合单克隆抗体(MAb)，通过抗原抗体反应，使所有表达EpCAM的细胞都与与磁性珠结合，通过磁选从溶液中剔除。捕获的细胞用细胞角蛋白(阳性检测)、CD45(阴性检测)和DAPI染色进行成像[13]。迄今为止，该系统得到了广泛应用，并为其他CTCs分离技术的比较设定了标准。该试验将每7.5 ml外周血中检测到的5个CTCs切断作为预测可行的指标。有研究发现，CellSearch技术是一种可行的预测乳腺、前列腺、非小细胞肺癌和其他上皮性肿瘤转移、无进展生存和整体存活的指标[12]。该检测技术的局限性主要在于敏感度低，无法检测EpCAM阴性肿瘤细胞。

1.2.2 CTC-chip技术 CTC-chip技术与CellSearch技术的基本原理相同。CTC-chip技术在其基础之上，再利用微流体学原理，在硅片上设置了78 000个微柱位点。当包含有Ep CAM抗原的CTCs流经位点时，可以被位点捕获，继而再利用细胞免疫化学技能对其进行检测分析。这项技术的显著优点是不用预处理就能使用整个外周血，一旦细胞在微柱位点上被捕获，就会被细胞角蛋白染色而变成可视化，以进行计数[14]。

1.2.3 ISET联合激光扫描细胞计数仪技术 此技术主要利用ISET富集原理，依据CTCs直径与其他血细胞及淋巴细胞直径的差异(CTCs直径＞10μm，而红细胞、白细胞、淋巴细胞直径＜8μm)，采用孔径为8μm的滤膜过滤预先固定的外周血，分离出肿瘤细胞，然后对滤过膜进行荧光标记，最后对被荧光标记的肿瘤细胞扫描计数。该方法的优点是能有效捕获有活力的肿瘤细胞，包括EpCAM阴性的肿瘤细胞；而且价格低廉、操作简便。缺点是直径较小的CTCs会被漏检，而且缺乏形态学统一鉴定标准[15]。

1.2.4 免疫磁珠负向富集联合受体靶向PCR检测 叶酸受体是一种细胞表面受体糖蛋白，在多种癌症(尤其是卵巢癌和肺癌)中高表达，已成为非小细胞肺癌患者重要的潜在药物靶点[16]。除了CTCs或活化的单核细胞[17]外，在循环系统中没有发现表达叶酸受体的细胞。

免疫磁珠负向富集联合受体靶向PCR检测技术利用负向富集的原理，通过带有磁珠的CD45抗体、CD14抗体分别标记白细胞和巨噬细胞，进而分离去除这两种细胞以负向富集CTCs。而后，在标本内加入肿瘤特异性叶酸受体-寡核苷酸耦合物探针标记，最后进行荧光定量PCR扩增分析。该技术的优点是对EpCAM阴性的肿瘤细胞依然有效，同时也避免了漏诊和假阳性，弥补了CellSearch技术、ISET技术的缺陷，目前已在肺癌检测中开展并有较大收获[18]。

1.2.5 阴性富集联合荧光原位杂交技术检测 利用白细胞表面抗原(如CD45)的特异性抗体与白细胞结合，将结合后的白细胞分离，从而分离出CTCs，称为阴性富集。通过该方法筛选出的全部种类CTCs保留了其完整特性，有利于后续分析，但纯度不够。荧光原位杂交技术是利用标记荧光素的核酸探针检测CTCs，该技术的敏感度及特异度均更高。将差相富集法和肿瘤标记免疫荧光染色与FISH结合，将会获得一种更优化的检测方式，可不依赖肿瘤上皮细胞表面表达的相关标志物，同时行肿瘤标志物染色、染色体计数双重计数。这种方法大大提高金额检测的敏感度及特异度，但能否应用于临床，需更多的研究数据支撑[19]。

1.2.6 CTCs体外培养 虽然近年来CTCs检测技术发展迅速，种类多样，但各有优缺点，在临床应用中未达标准化。且其主要应用局限于简单的计数方面，不能鉴别各CTCs亚群，也不能明确具有活性的CTCs来自哪一个亚群。进入外周血CTCs都部分或完全发生了EMT，如何对于这部分微量的CTCs进行分子分析及相关功能研究面临着艰难的技术挑战。因此，对极少数目的侵袭和转移活性的CTCs实现有效的体外扩增可完成这一技术挑战。有众多学者致力于该技术的研究：Zhang等[20]采用微流体装置捕获早期肺癌患者CTCs，然后与成纤维细胞在三维基质中原位共培养，但最终无法获得纯的CTCs；Yu等[21]通过CTC-Chip差相富集CTCs，并尝试了多种的体外培养条件，成功有限。由此可见，虽然CTCs的体外培养在CTCs生物学特性研究、精确治疗等方面前景广阔，但技术上面临诸多困难，大部分技术在样本初处理、富集以及培养过程中都会对CTCs造成不可逆的损伤。

2 CTCs检测对肺癌的临床意义

2.1 肺癌的早期筛查及早期诊断 即使在肿瘤发展的早期阶段，血液中也可以检测到CTCs[22]，因此，它们可能成为癌症筛查的手段之一。在健康人或良性肿瘤患者的血液中，被归类为CTCs的细胞非常罕见。在肺癌方面，有学者试图将CTCs评估与既定的筛选方法结合起来。He等[23]着重于提高低剂量CT筛查方案的特异性，将其与随后的CTCs评估相结合，通过对比低剂量CT筛查已确定的肺“磨玻璃”结节患者和健康对照者的CTCs计数，发现只有少数肺结节患者的血液中有CTCs，但随后的分子分析发现这些CTCs具有“恶性倾向”。可见，将低剂量CT筛查方案与CTCs结合可以提高其特异性。还有一些学者对COPD患者的CTCs水平进行了评估，在168例患者中有5例(3%)检测出CTCs的患者都在4年内罹患肺癌；此外，在监测期内无CTC阴性患者患上癌症[24-25]。由此可见，CTCs检测有助于肺癌的早期筛查、诊断和早期干预，提高治愈率及生存期。

2.2 肺癌分期、转移及疾病进展监测 血行转移是造成肺癌患者病情进展、复发直至死亡的主要原因。研究发现，即便肿瘤直径≤1 cm也可能发生转移，而无临床转移病灶的早期肺癌患者，外周血中也可以检测到CTCs[26]。虽然血液中检测到CTCs就能判定患者一定发生了转移，但很多研究显示肺癌CTCs计数与肿瘤分期明显相关[26-27]。CTCs计数和计数变化是评估癌症是否进展的基本但有效的指标，CTCs计数已被证明是包括肺癌在内的许多癌症类型的预后预测指标[28]。CTCs计数是一种能够实时评估疾病发展的工具，相比临床病理活检具有创伤小、可重复性强等优点。术后或化疗后CTCs计数的下降可能是疾病缓解的迹象；相反，CTCs计数的增加意味着疾病的进展，需要重新评估，选择新的治疗方案[29]。

2.3 肺癌的个体化治疗 临床上肿瘤治疗方案的选择主要依据肿瘤的TNM分级和患者的综合评分。目前，只有极少部分的早期患者可仅接受手术治疗，其他绝大部分的中、晚期患者无论能否手术，均需接受其他治疗(如化疗、放疗、分子靶向治疗及免疫治疗)或联合治疗。由于不能对原发肿瘤是否进展或是否发生复发转移进行预估，故无法选择合适的治疗方案，从而延误治疗。CTCs计数和分子分型能够精确地预测疗效，判断预后；同时，还可作为一种实时活检工具，为肺癌的个体化治疗提供更多、更精准的依据[30]。多项研究表明，检测患者外周血CTCs对评估化学治疗、放射治疗等多种不同肺癌治疗方法均有意义[31-32]。此外，外周血CTCs检测还可用于后续的肿瘤基因分析，为分子靶向治疗提供一定依据[33]。

3 CTCs检测应用于临床存在的问题

虽然很多研究证实CTCs在肺癌等肿瘤诊疗中应用广泛，但由于其在外周血中的稀有性，导致其检测困难。目前已有众多学者致力于多种检测方法的研究，但由于标准范围的难确定性，仍然只有CellSearch技术被美国食品药品监督管理局批准用于临床，因其敏感度及特异度不高，导致CTCs临床推广使用困难。原发肿瘤释放数以万计的肿瘤细胞入血，却只有不到0.01%的CTCs能在外周血中存活并且形成转移[34]。Allard等[35]利用CellSearch技术对99例肺癌样本进行检测，发现分别有20%、14%、10%、6%的外周血样本中CTCs数目(个)≥2、≥5、≥10、≥50。Devriese等[36]用免疫磁珠负向富集法表明，46例非小细胞肺癌患者外周血中有21例(46%)存在CTCs，46例健康对照组中有3例(7%)可查到CTCs。在另一项研究中，Hofman等[37]以ISET富集法表明，外周血CTCs的存在与肿瘤的分期和肿瘤组织学无关。以上研究均说明，CTCs在患者外周静脉血中的存在提供了一个不完整的、非常有限的信息，尚不足以在临床中使用。

4 肺癌动静脉CTCs含量及空间异质性的机制探讨

由于外周静脉采血相对简单且易被患者所接受，目前对CTCs的认识大多来自外周静脉血，这可能只是其循环过程中的一次快照，不能代表整个循环过程。有学者对73例原发性肝癌患者在肿瘤切除前分别从周围静脉、外周动脉、肝静脉、下腔静脉和门静脉抽血检测CTCs，数据表明CTCs在循环过程中其细胞分布和生物学特征存在着明显空间异质性，不同部位CTCs的测量有助于揭示肝癌转移的新机制，预测术后复发或转移模式等[38]。为了证实血管中的高剪切应力可能导致CTCs的EMT表型，这些学者还制作了一个微流控系统，研究动脉和静脉剪切力对肝癌CTCs的影响，结果表明，在动脉剪切力条件下，EMT转录因子在5 min内开始上调，与静脉剪切力条件下相比，差异有显著性(P＜0.05)，其他间充质表型信号在动脉剪切力条件下循环30 min后开始增加，而上皮表型相关信号在循环30 min后开始下调。这些结果表明CTCs在通过动脉血管时即激活了EMT程序[38]。

Terai等[39]调查了17例葡萄膜黑色素瘤患者股总动脉和前肘静脉配对血液标本中CTCs的数量，CTCs采用标准CellSearch进行分析，结果所有股总动脉标本均检出CTCs，而在同一患者的静脉血标本中，仅9/17(52.9%)可检出CTCs，动脉血与外周静脉血比较差异有统计学意义(P＜0.001)。以上研究表明，不同部位血管中CTCs分布不同；与动脉血相比，外周静脉循环中的CTCs明显下降，这意味着静脉血标本可能不是检测患者CTCs的合适来源。由于肿瘤细胞在周围静脉系统循环时可能凋亡和碎裂[40]，导致外周静脉血与动脉血中的CTCs不一样，甚至更脆弱。

众所周知，肺组织血供来源于体循环和肺循环，且生理状态下肺循环占绝对优势。有研究证明肺癌分别接受体循环(支气管动脉)及肺循环(肺动脉)的供血，肺循环供血在早期肺癌中尤其明显[41]。由于肺癌独特的肺静脉引流的特点，肺静脉中CTCs含量明显提高，特别是在早期肺癌[42]。因此，肺静脉CTCs检测可以提高早期肺癌CTCs的检测率。根据肺循环特点，肺静脉中为动脉血，未经肺循环系统的微循环经过左心系统直接进入体循环的外周动脉系统，因此，外周动脉血中CTCs含量应接近肺静脉血，而肺静脉血抽取困难(需在手术中留样)，临床应用受限。抽取外周动脉血方便、创伤小，更利于临床应用；而外周静脉血要经过体循环系统的微循环过滤，CTCs会有衰减。类似的是，经支气管静脉入血的CTCs需经过肺循环系统的微循环及体循环系统的微循环两层过滤才能至外周静脉，期间会伴有更明显的CTCs衰减。根据以上研究及理论，推断肺癌患者动脉血中CTCs含量可能会明显高于静脉血，而且动脉血中的CTCs也已经发生了EMT，当然这需要相关的研究去证实。

5 动静脉中肺癌CTCs含量的临床意义

CTCs的研究注重于CTCs计数和CTCs特征两方面。CTCs计数是系统治疗后的反应标志物之一，可早期发现患者的微转移及复发；而CTCs分子表征则有助于评估肿瘤异质性，以检测其耐药性分布，明确药物靶点。肺癌CTCs的研究是目前临床研究的热点之一，但是根据某些特定生物标志物(如EpCAM)的CTCs研究发现，肺癌CTCs检出率、检出量与肝细胞癌、乳腺癌等其他癌症相比均有下降[43]。CTCs数量取决于被检血液样本的容量和所应用的技术，并最终影响各种统计结果的准确性。静脉采血是一种简单、微创的方法，这种方法使许多癌症患者都能很容易地接受CTCs检测。由于一些CTCs在血液循环时可能被隔离或破坏，或由于技术原因可能在分析过程中丢失，导致外周静脉CTCs的检出率很低，限制了其在临床中的推广使用，所以在肺癌等肿瘤中，静脉血CTCs的测定价值可能受限。前文已经提到，在不同的血液来源中，CTCs的分布及异质性也可能不同，肺癌动脉血中的CTCs含量可能大大高于静脉血，其生物学特性与分子表达与静脉血也不相同。而且动脉血中的CTCs受血液剪切力影响较小，受损较轻，更易于体外培养，如能通过研究证实，将大幅度提高CTCs检测的敏感度，并能初步构建肺癌患者CTCs时间和空间等分布模型，提高对CTCs异质性的认识，并了解其转移机制，掌握其药敏及耐药性等，使其能在临床上获得更多、更广泛地应用，让更多的肺癌等肿瘤患者获得早期诊断及更有效的治疗。

综上所述，CTCs检测在肺癌早期筛查诊断、转移复发评估、个体化治疗等应用方面得到进展。虽然目前CTCs检测方法多样，但由于其在静脉血中的稀有性限制了其在临床上的广泛应用；研究对比动静脉中肺癌CTCs差异性，有望打破这种局限性，使其获得临床上的广泛应用。

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