浅谈新型冠状病毒疫苗的研发

朱飞 崔艳慧 潘频华

中南大学湘雅医院呼吸与危重症医学科，长沙410008

冠状病毒是1937年从鸡身上分离出来[1]。1965年，Tyrrell等[2]从普通感冒患者鼻洗液中分离出一株病毒，命名为B814病毒。Hamre等[3]用人胚肾细胞分离到类似病毒，代表株命名为229E病毒。1967年，Mclntosh等[4]用人胚气管培养从感冒患者中分离到一批病毒，其代表株是OC43株。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。冠状病毒主要感染鸟类和哺乳动物，并仅限于其天然宿主，难以跨越物种屏障，在早期并未发现动物冠状病毒感染人类的相关报道[5]。2002-2003年间SARS爆发流行，感染人数达8096例，全球有774例死亡病例[6]。2012-2019年，全球报告了2 494例实验室确诊中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-Co V)感染病例，其中有858例死亡病例[7]。冠状病毒的跨物种传播带给人类惨痛的教训。时至今日，新型冠状肺炎(COVID-19)全球性的爆发流行再次给人类敲响警钟。

1 冠状病毒概述

冠状病毒是一种单股正链RNA的包膜病毒，基因组长度为26～32 kb，是基因组最长的RNA病毒。冠状病毒根据其遗传物质和抗原可分为四大类：α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒以及δ-冠状病毒[8]。目前在人与人之间传播的冠状病毒有HCo V-OC43、HCo V-229E、HCo VNL63、HCo V-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCo V)、MERS-Co V及最近发现的新型冠状病毒，即严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Co V-2)，其 中HCo V-229E、HCo V-NL63属于α-冠状病毒，而HCo V-OC43、HCo V-HKU1、SARS-Co V、MERS-Co V和SARS-Co V-2属于β-冠状病毒，后3种β-冠状病毒传染性极强，为人畜共患病毒[9]。冠状病毒基因组编码4个主要的结构蛋白：刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白[10]。S蛋白介导病毒与宿主细胞表面受体结合，促使病毒进入受体细胞[11]。N蛋白的主要功能是结合冠状病毒RNA，组成核衣壳[12]。M蛋白是结构最为丰富的蛋白，可以定义病毒包膜的形状[13]，也被认为是冠状病毒的主要组装者，与其它所有冠状病毒蛋白相互作用[9]。E蛋白是主要结构中最小的蛋白，复制周期中在感染者体内的细胞大量表达，但只有一小部分参与病毒包膜的构建[10]，大部分E蛋白定位在细胞内的运输中心，如内质网和高尔基体[15]。

SARS-Co V-2在冠状病毒的系统树上与SARS-Co V密切相关[16]，SARS-Co V-2与SARS-Co V和BAT-Co V的基因组序列同源性分别为79.6%和96%[17]，国际病毒分类委员会将其命名为SARS-Co V-2。SARS-Co V-2是一种球形包膜病毒，直径50～200 nm，其基因组长度为30 kb[18-19]，推测SARS-Co V-2有10～12个开放阅读框(open reading frame，ORF)[20]。SARS-Co V-2基因组编码的四种结构蛋白中，S蛋白对SARS-Co V-2的附着和进入宿主细胞起重要作用[19]。在感染过程中，三聚体的S蛋白会被裂解成亚基S1和S2，S1亚基含有受体结构域(receptor binding domain，RBD)负责和受体结合，S2则负责与膜融合[21]。SARS-Co V-2的S蛋白和SARS-Co V S的结合受体一样，都是通过结合宿主细胞的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受体[19]进入宿主细胞。Wrapp等[18]通过3D结构分析表明，与SARS-Co V相比，SARS-Co V-2与ACE2受体的亲和力更高。

2 SARS-CoV-2疫苗的研发策略

S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白是冠状病毒的包膜蛋白，位于病毒表面，理论上都能产生中和抗体保护机体。在SARS-Co V或MERS-Co V基因组编码的蛋白中，S蛋白是主要的病毒抗原成分，可诱导抗体产生，从而阻断病毒结合，刺激宿主免疫反应，故以S蛋白作为疫苗开发的主要目标。对于SARS-Co V-2，用单克隆抗体进行的研究表明，感染SARS-Co V-2的患者对S蛋白，特别是S蛋白RBD，产生了强大的中和抗体反应[22-23]。在SARS-Co V疫苗的研究中，已经针对S蛋白开发出了亚单位疫苗、重组载体疫苗和DNA疫苗等。借鉴早期SARS-Co V和MERSCo V疫苗的研发经验，Tostanoski等[24]利用26型腺病毒作为载体导入SARS-Co V-2S蛋白相关基因，构建稳定表达S蛋白的26型腺病毒载体疫苗，在仓鼠动物模型中该疫苗单次免疫可诱导结合和中和抗体反应，并对SARS-Co V-2导致的体质量减轻和肺炎具有保护作用，降低病死率。陈薇教授团队同样以腺病毒为载体，开发出表达SARS-Co V-2S蛋白的复制缺陷Ad5载体疫苗，并表明黏膜接种Ad5-nCo V可以完全保护小鼠的上呼吸道和下呼吸道免受SARS-Co V-2感染[25]。单次肌肉接种Ad5-nCo V可保护小鼠肺部免受SARS-Co V-2感染，并显著减少病毒在小鼠和雪貂上呼吸道的复制。目前，Ad26疫苗和Ad5-ncov疫苗均已进入Ⅲ临床试验。

除了S蛋白，对SARS-Co V的早期研究表明，大多数感染者对N蛋白产生了抗体应答[26]。然而，接种表达N蛋白的疫苗不会对SARS-Co V攻击产生保护作用，还会增加感染，其特征是肺内嗜酸粒细胞浸润增加[27]。同样，接种了表达N蛋白的重组痘苗病毒的BALB/c小鼠在随后的SARS-Co V感染时观察到病毒感染增强[28]。以上研究均表明N蛋白不适合作为疫苗靶标。

尽管已证明SARS-Co V患者血清对M蛋白有反应，由于免疫原性较低，M蛋白作为疫苗靶标的可能性较低[29]。有研究表明可以将E蛋白为靶标开发疫苗[16，30]。E蛋白参与MERS-Co V的毒力构建，敲除E蛋白的编码基因可导致病毒毒力减弱。Almazan等[16]研究表明缺失E蛋白的MERS-Co V仍具有复制能力，但传播能力有缺陷。在敲除E蛋白基因的SARS-Co V中也观察到类似现象[32]。这为SARS-Co V-2疫苗的开发提供了另一种思路，可以通过对E蛋白的基因进行编辑获得减毒病毒，但对于其用于减毒疫苗的制备及其安全性还有待进一步研究。

除了以结构蛋白为靶标开发疫苗外，还可开发多表位疫苗。多表位疫苗是一种同时携带多个抗原表位的疫苗，这类疫苗可以和不同型别的MHC分子结合，实现高效提呈，并可诱导很强的细胞免疫。有研究发现处于恢复期的SARS-Co V感染者的抗体应答是短暂的[31]，而T细胞免疫可以提供长期保护[32-33]，所以研制出多表位疫苗对于SARS-Co V-2防治也有着重要作用。Baruah和Bose[34]通过生物信息分析在SARS-Co V-2表面糖蛋白鉴定出5个CTL表位、3个连续的B细胞表位以及5个不连续的B细胞表位，发现除了CTL表位-VVNQNAQAL与SARS-Co V的相同外，与BAT-Co V，SARS-Co V和MERS-Co V相比，所有鉴定出的连续CTL和B细胞表位对于SARS-Co V-2是唯一的，而CTL表位-EPVLKGVKL与其他冠状病毒的相应序列都不匹配。Ahmed等[35]则分析那些已经被实验室确定的SARS-Co V的B细胞和T细胞表位，发现只有23%的T细胞表位和16%的B细胞表位可在SARS-Co V-2中找到，并且没有突变。在这些表位因病毒基因组突变被取代前，制备出SARS-Co V-2相关疫苗才能有效遏制SARSCo V-2的传播。

借鉴早期SARS-Co V和MERS-Co V的开发经验，SARS-Co V-2疫苗的研发进展迅速。截至2020年12月10日，WHO公布全球共有52种SARS-Co V-2候选疫苗进行临床评估，其中有13种候选疫苗进入Ⅲ期临床试验，162种SARS-Co V-2候选疫苗尚在临床前试验[36]。

3 疫苗研究中所面临的问题

3.1 冠状病毒的变异 冠状病毒为RNA病毒，由于RNA聚合酶没有校正机制，导致很高的错误突变率，这种突变可能加速病毒变异。有研究发现，在2002-2003年SARSCo V的流行期间，SARS-Co V发生突变以便于更好结合到宿主细胞受体并在宿主细胞中复制，从而增强毒力。而MERS-Co V自发现以来并未发生实质性突变，可能是因为MERS-Co V结合的功能性受体CD26是独特的，所以病毒在健康宿主中发生突变的潜力有限[37]。Rahman等[38]以SARS-Co V-2武汉-HU-1株的全基因组序列为参考，通过非同义突变分析从全球共享所有流感数据库(GISAID)中经处理得到35750个全长S蛋白基因序列，发现27

801株(77.77%)SARS-Co V-2变异株。同时，该团队发现SARS-Co V-2S蛋白共有988个独特的氨基酸替换，分布在660个位点，其中有11个高度可变的位点：32、142、146、215、261、477、529、570、622、778、791、1146、1162。在第614位出现了2个变异体即D614和G614，而在74.82%(n=26749)的序列中发现了D614G。D614G突变出现于COVID-19流行的早期，Zhang等[39]的研究表明D614G的突变增加了SARS-Co V-2S蛋白的密度及传染性。该突变的频率迅速增加已成为全球病毒的主导形式[38，40]。Weissman等[41]的研究表明接种了SARS-Co V-2疫苗的小鼠、非灵长类动物和D614变异SARS-Co V-2的免疫原的人类可产生中和抗体来中和带有G614突变与D614突变的SARS-Co V-2S蛋白，这表明G614突变或D614突变的SARS-Co V-2并不能逃脱中和。Weissman团队的研究结果缓解了对于SARS-Co V-2突变的担忧，但依旧警惕未来病毒的变异导致相关疫苗的作用减弱等。

3.2 动物模型的选择 由于SARS-Co V-2的S蛋白和SARS-Co V的S蛋白都可以通过结合宿主细胞ACE2受体介导病毒感染，理论上用于研究SARS-Co V免疫应答机制的动物模型也可用于SARS-Co V-2疫苗的研究。早期用于研究SARS-Co V的动物模型已经有恒河猴、小鼠、猫、叙利亚金色仓鼠和雪貂等，而用于SARS-Co V疫苗评价的包括小鼠和恒河猴[42]。曾经被用于SARS-Co V感染研究的小鼠模型包括BALB/c、C57BL6(B6)和129Sv Ev谱系小鼠[43-45]。但Zhou等[46]的研究表明SARS-Co V-2可与人、中国马蹄蝙蝠、麝猫或猪的ACE2受体结合，但不能和小鼠的ACE2受体结合。Shang等[47]的研究表明ACE2受体上和S蛋白RBD结合的关键位点为第31位和第353位的赖氨酸残基位点。而小鼠ACE2受体的第82位点和第353位点的残基与人类的ACE2受体的不一样，导致了SARSCo V-2的S蛋白不能结合小鼠的ACE2受体[48]。目前，有2种方法可使小鼠感染SARS-Co V-2。第一种是通过SARSCo V-2在BALB/c小鼠的肺部连续传代，直到病毒S蛋白RBD适应于小鼠ACE2受体[49]。Wang等[50]采用该种方法得到了小鼠适应性病毒HRB26 M，该病毒能有效感染BALB/c小鼠和C57小鼠的上呼吸道和下呼吸道，并导致肺部病变。第二，利用基因工程技术建立表达人ACE2受体的小鼠模型或对S蛋白RBD进行改造，使小鼠感染SARS-Co V-2[51]。早在MERS-Co V相关研究中，小鼠不表达人类二基肽酶4受体[52]。Zhao等[53]则利用转基因技术建立表达人类二基肽酶4受体的小鼠模型，该模型在感染MERS-Co V后表现出急性呼吸道损伤及肺外器官损伤。Sun等[54]最近利用CRISPR/Cas9技术开发了一种表达人ACE2受体的转基因小鼠模型，将人ACE2受体cDNA敲入小鼠ACE2位点。这个模型对SARS-Co V-2感染高度敏感。然而，小鼠在感染SARS-Co V-2后的体质量减轻和肺部病变比较轻微。

除小鼠外，叙利亚仓鼠也被认为是对SARS-Co V-2高度易感的临床前模型。Rosenke等[55]的研究表明叙利亚仓鼠对SARS-Co V-2高度易感，并可导致中到重度支气管间质性肺炎。另外两项研究表明在实验性鼻腔感染后，叙利亚仓鼠可表现出轻到中度的临床症状，并在感染后很早(接种后1～2d)就出现进行性体质量下降。所有受到不同SARS-Co V-2分离株感染的仓鼠都一直显示出呼吸窘迫的迹象，包括呼吸困难[56-57]。

早期研究表明，恒河猴、非洲绿猴和食蟹猕猴可感染SARS-Co V，并可在这些不同种非人类灵长动物中发现病毒感染后的肺炎征象[58-60]。Lu等[61]的研究表明恒河猴、食蟹猕猴和普通恒河猴可感染SARS-Co V-2，且在肺部均观察到了肺损伤和其他组织病理学异常，而恒河猴和食蟹猕猴的肺损伤更为明显。同样，最近有研究证明非洲绿猴是适用于SARS-Co V-2的非人类灵长类动物模型[62]。然而，面对众多的候选药物和疫苗，非灵长类动物的供应有限，这使得它们成为一种更加宝贵的资源。因此，可通过较小的哺乳动物模型优先测试药物，以证明其耐受性和有效性。小鼠、叙利亚仓鼠是目前比较合适的用于评估疫苗效果的小动物物种。但与小鼠相比，用于疫苗评价及研究的叙利亚仓鼠模型依旧较少。然而，不同小鼠模型感染SARS-Co V-2所表现出的临床症状并不能完全反映人类感染SARS-Co V-2出现的临床症状，所以对于疫苗的临床前实验研究，则需要多种动物模型联合评估疫苗的效果。

3.3 抗体依赖性增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE) ADE是病毒的疫苗设计及抗体类药物制备考虑的主要问题之一。ADE早期受关注是因为SARS患者的血清转化及中和抗体反应与患者临床症状严重程度及病死率密切相关[63]。而COVID-19患者中也有类似发现，更高的抗SARS-Co V-2抗体滴度与更严重的疾病密切相关[64]。ADE在病毒感染中主要通过2种机制发生。(1)通过抗体Fc段与靶细胞Fc受体结合，促进表达Fcγ受体ⅡA的免疫细胞对病毒的摄取，使病毒进入免疫细胞，并在细胞内复制和扩散，导致感染增强。(2)病毒与抗体结合激活补体途径，形成病毒-抗体-补体复合物。该复合物与细胞表面补体受体结合，促进病毒内化与感染增强。当低滴度的非中和抗体或亚中和抗体不再发挥中和作用时，这两种ADE的途径都有可能发生[65]。在SARS-Co V疫苗的开发过程中，Kam等[66]发现了包含全长S蛋白的VLP疫苗存在抗体依赖性感染增强的现象。Wan等[67]通过体外细胞实验证明MERS-Co VRBD的特异性中和单克隆抗体MAb(Mersmab1)可模仿病毒受体介导MERS-Co V的ADE现象产生。Luo等[68]用SARS-Co V灭活病毒疫苗建立了低中和抗体水平的恒河猴模型，并用SARS-Co V感染该模型，却并未见到病毒复制增强。另一项研究中，Wang等[69]用SARS-Co VS蛋白的4个B细胞多肽表位免疫猕猴后，发现其中3种多肽可诱导抗体保护猕猴免受病毒攻击，另一种多肽则明显增强细胞及猕猴SARS-Co V的感染，并导致猕猴出现更严重的肺损伤。因此，关于ADE相关的研究结果有很大的差异，这可能与疫苗的策略有关。理论上诱发病理性ADE的疫苗如灭活病毒疫苗，可能含有非中和抗原靶点和/或非中和构象的S蛋白，为抗体提供了大量非保护性靶点，这些抗体可能通过对其他呼吸道病原体观察到的机制引发额外的炎症。因此，以S蛋白中和抗原靶点的表位设计为表位疫苗以减少非中和抗体的产生，可能是解决这一问题的潜在方向之一。另一种降低ADE发生风险的潜在方向为提高中和抗体的效价。Liu等[70]发现Fc融合蛋白可显著增强SARS-Co V-2RBD免疫原诱导的中和抗体滴度，佐剂MF59可进一步增强RBD-Fc融合蛋白的抗原性，降低ADE的发生风险。

4 总结

全球COVID-19疫情仍在继续，快速开发SARS-Co V-2疫苗已成为当务之急。目前，全球已经有200多种疫苗处于研发中，有13种候选疫苗进入Ⅲ期临床试验，这让我们看到了结束疫情的希望。目前，尚有162种SARS-Co V-2候选疫苗处于临床前试验，仍然需要考虑SARS-Co V-2疫苗研制中所存在的问题，如ADE现象、病毒的突变、动物模型的选择等。除此之外，表位疫苗的表位选择、疫苗佐剂的选择、疫苗的效果评价等问题也不能忽视，期待不久后研发出更加安全有效的疫苗以应对COVID-19疫情。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突