lncRNA在肝细胞肝癌中的研究进展

李松，陆轶杰，吴建武，蒋新卫

（南京医科大学附属苏州医院 肝胆胰外科，江苏 苏州 215000）

据2021年全球癌症数据统计，原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）在所有恶性肿瘤中发病率排名第七，由于其恶性度高，进展快，病死率排名第二，仅次于肺癌[1]。原发性肝癌起源于肝脏上皮组织，病理学上可分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、胆管细胞癌及混合型癌，其中HCC是主要类型。目前，对于肝癌的治疗多采取以外科手术为主，联合靶向、免疫、介入、放化疗、中医等的综合疗法[2]。虽然对于早期肝癌的治疗效果有了很大程度的提升，但总体上肝癌患者的长期生存状况仍不乐观，5年生存率仅为18%左右。病毒性肝炎导致的肝硬化是我国肝癌最常见的诱因[3]，但肝癌发生发展的具体机制仍不清晰，难以实现精准的个体化治疗。因此，亟需寻找一种新的分子标志物，为肝癌的早期诊断及精准治疗提供新的思路。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）近年来逐渐引起学者们的关注，其在HCC中具有影响肿瘤细胞增殖、转移的作用[4]，提示lncRNA有望成为改善HCC诊断及治疗的新的切入点。

1 关于lncRNA

1.1 lncRNA的概念和特点

lncRNA现定义为长度超过200 bp的无编码蛋白作用的DNA转录产物[5]，由日本学者在小鼠cDNA测序研究中首次提出[6]。根据lncRNA在基因组中的定位将其分为lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA和基因间lncRNA五类[7]。lncRNA在人类基因组广泛转录，但具有高复杂性和低保守性的特点，表现在其与蛋白编码基因相比具有更高的细胞表达特异度，表达量也会随环境和时间动态变化[8]，因此曾被认为是RNA聚合酶保真性差而致的转录噪声[5]。随着研究的深入，学者们发现某些lncRNA的表达限于特定的发育背景，受到一定的精确调控，如大量的小鼠lncRNA在其胚胎干细胞分化阶段和大脑中高度表达[9]，提示其可能具有某些特定的功能。lncRNA与mRNA相比转录本更短，包含的外显子更少，稳定性也较差。lncRNA也可含有一个或多个开放阅读框（open reading frame，ORF），但基本不通过翻译蛋白质发挥生物学作用[10]。

1.2 lncRNA的作用方式

lncRNA主要参与转录、转录后和翻译后等基因表达过程[11]，可以通过多种方式与DNA、RNA、蛋白质相互作用从而调节DNA的表达和蛋白质的合成，具体的作用方式有以下几种。（1）染色质重塑：lncRNA可以通过招募染色质重构复合物到特定的基因组位点来介导表观遗传变化。Plath等[12]研究发现，X染色体的失活是由标志性的lncRNA Xist（X-inactive specific transcript）介导的。Xist位点内的非编码转录本RepA招募了染色质重构复合体PRC2，以此沉默X染色体。由相应的lncRNA引导的染色质重构复合物是一种广泛的染色质修饰模式。（2）招募并整合RNA结合蛋白的功能到转录程序中[13]。（3）充当调节转录因子、催化蛋白活性的辅助因子[14]。（4）调节RNA聚合酶：研究发现lncRNA-LEENE的转录可增强RNA聚合酶II（RNA Pol II）结合内皮型一氧化氮合酶（eNOS）启动子，因此增强eNOS转录[15]。（5）识别互补序列并充当分子海绵，与mRNA互作，调控mRNA转录后处理的各个步骤[16]。

2 lncRNA在HCC发生发展中的作用

2.1 lncRNA调节HCC细胞的增殖和侵袭能力

研究发现，一些lncRNA可影响HCC细胞体内外增殖和侵袭能力。2007年，Kartin等[17]首次报道了在HCC中高度特异性上调的非编码RNA，并将其命名为HULC（highly up-regulated in liver cancer）。有研究发现，HULC可以通过“海绵结合”miR-377-5p促进HepG2 细胞的增殖和侵袭；敲低HULC后，小鼠体内成瘤也明显缩小[18]。MALAT1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1）是一个位于11q13 的8.5 kb的保守的核保留lncRNA，其在HCC细胞中显著高表达[19]。Huang等[20]学者的研究显示，MALAT1可将染色质重塑复合物SWI/SNF（switching/sucrose non-fermentable）的催化亚基BRG1（brahmarelated gene 1）招募至促炎因子IL-6和CXCL8基因的启动子，激活转录因子NF-κB后增加两种促炎因子的表达，从而促进QGY-7701/7703 细胞增殖和侵袭能力。MEG3（maternally expressed gene 3）定位于染色体14q32.3，长度约为1.6 kb[21]。研究发现，HCC组织和细胞系中的MEG3 水平显著降低，特别是在晚期HCC患者中，敲除MEG3可显著促进肝癌细胞的增殖和侵袭，加速细胞周期，其机制可能与抑制AP1G1表达和激活PI3K/AKT通路有关[22]。Duan等[23]的研究显示：HOTAIR（HOX transcript antisense intergenic RNA）在HCC细胞系中高表达，敲低后可上调miR-34a的表达，抑制HepG2和SMMC7721细胞的增殖和侵袭，促进凋亡。总而言之，多种lncRNA的异常表达促进了HCC的恶性表型，作用模式可为染色质修饰或结合下游miRNA、蛋白质等，提示lncRNA是人为抑制肿瘤进程的新靶点。

2.2 lncRNA调节HCC上皮-间充质转化

上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）对包括HCC在内的多种癌症的进展非常重要，可以赋予细胞转移和侵袭的能力，减少凋亡与衰老，促进免疫抑制。lncRNA HOXA-AS3在HCC细胞中高表达，在细胞系SMMC-7721、HepG2、Huh7 和HCC-LM3中将其敲除可以降低N钙黏蛋白（N cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达，增加E钙黏蛋白（E cadherin）的表达，表明lncRNA HOXAAS3能促进HCC的EMT过程[24]。有学者认为，癌细胞可以获得一种杂交上皮/间充质（E/M）表型。具有混合E/M表型的细胞混合上皮和间充质特性，它们对治疗更具耐药性，也更有能力启动转移性病变。HCC中，过表达HOTAIR通过调控Caveolin-1的表达和激活，抑制c-Met的表达和激活，为E/M表型提供了生存优势，促进了HCC的发展[25]。另有研究指出，在HCC中，MALAT1促进了zeste同源物2（EZH2）在miR-22和E-cadherin启动子区域的富集，抑制miR-22和E-cadherin的表达，正向调控SNAI1，在EMT中发挥重要作用[26]。

2.3 lncRNA调节HCC组织血管生成

血管生成是包括HCC在内的实体肿瘤的显著特征[27]。Lu等[28]研究发现，在HCC中HULC作为分子海绵靶向结合miR-107，导致转录因子E2F1的上调，后者结合并激活SPHK1启动子，而SPHK1/S1P/S1PR1/3信号通路在肿瘤血管生成中起重要作用。lncRNA HABON（hypoxia-activated BNIP3 overlapping non-coding RNA）是一种由缺氧激活的lncRNA，该lncRNA不仅受到缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的调控，而且在肝癌细胞缺氧时其表达水平显著升高。在缺氧细胞中，HABON可被HIF-1α转录激活，并与HIF-1α相互作用，促进其蛋白降解，最终通过影响HIF-1α靶基因的转录而发挥作用。HIF-1α的靶基因包括EPO编码基因和VEGF编码基因等，在肿瘤血管生成中有着重要作用[29]。

2.4 lncRNA调节HCC肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）特性

CSC为肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的一类细胞。CSC通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力，其运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能，因此肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。有研究表明，在稳定感染HBV的HepG2 X细胞中，lncRNA MALAT1 的表达上升，其形成克隆及在裸鼠体内成瘤的能力均较HepG2细胞增强。敲减MALAT1降低CD44、CD133、EpCAM等CSC标志物的基因表达，提示MALAT1能够促进HepG2 X细胞的CSC分化和肿瘤发生[30]。Wang等[31]学者的研究显示，HULC加速了依赖CyclinD1的人肝癌干细胞的进展。Jiang等[32]研究发现，MEG3通过阻断维持端粒长度的复合物（POT1-Exo1-TRF2-SNM1B）的形成，并通过增加p53和HULC之间的相互作用，减少复合物与端粒的结合，从而减少端粒长度。最终，MEG3通过降低端粒酶活性和减弱端粒重复结合因子2（TRF2），抑制人肝癌肿瘤干细胞的生长。

2.5 lncRNA增强HCC对药物的敏感性

晚期肝癌目前最主要的治疗方式是化疗、靶向治疗、免疫治疗。肿瘤耐药是药物治疗的一大阻碍。有研究表明，lncRNA HOTAIR可以通过抑制miR-217来增加肝癌患者对索拉非尼（sorafenib）的耐药性[33]，另一方面也可通过调节Akt磷酸化和Wnt/β-catenin信号与miR-34a相互作用，削弱HCC对于紫杉醇的耐药[23]。另有研究发现，lncRNA-MT1JP与miR-24-3p的海绵结合释放了BCL2L2（Bcl-2 like 2），从而形成了一个正反馈回路，降低了肝癌细胞在体内外对仑伐替尼（lenvatinib）的敏感性[34]。Li等[35]研究证明，BANCR（BRAF lncRNA）在HCC细胞系Huh7中过表达，其下调抑制了Huh7细胞的活力，促进了凋亡，并抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭。伴有BRAF突变的晚期HCC患者对TKI的耐药更显著，抑制BRAF可能成为治疗肝癌的一种策略，而BANCR可能是介导肝癌细胞增殖和TKI逃逸的重要分子[36]。

3 lncRNA作为HCC肿瘤标志物

某些lncRNA在HCC的异常表达及组织特异性，使其有望成为新的肿瘤标志物[37]，帮助判断HCC的发生及预后。HCC患者血浆中HULC转录产物显著升高[38]。此外，与来自健康个体的血清相比，在乙型肝炎病毒阳性患者的血清中发现了更高水平的HULC转录本[39]。这意味着HULC可能成为合适的诊断标志物[40]。在Yuan等[41]的研究中，通过对血清样本的qRT-PCR检测，筛选并验证出LINC00152、RP11-160H22.5和XLOC014172可能是HCC与慢性肝炎患者的诊断标志物。一些lncRNA可能与肝癌预后密切相关。Lee等[42]的研究表明，高表达PLEKHA8P1的原发性肝癌患者，总生存期和无病生存期均有降低趋势；同时，PLEKHA8P1的表达与原发性肝脏肿瘤的组织学分级呈正相关。Wu等[43]学者的研究表明，HOTTIP（HOXA transcript at the distal tip）表达是HCC肝移植术后肿瘤复发和总生存时间较低的独立预后因素。UCA1（urothelial cancer associated 1）在HCC细胞中异常高表达[44]。有荟萃分析发现，UCA1 上调与肿瘤体积较大、TNM晚期密切相关，而UCA1过表达与更短的总生存期显著相关[45]。目前对于HCC的诊断多以甲胎蛋白等传统的分子标志物为主，诊断存在肿瘤初期升高不显著的弊端，且难以判断预后，lncRNA因此有望成为早期诊断并预测疾病结局的新的分子标志物。但lncRNA普遍表达量极低，虽然有二代测序等新方法，但仍缺乏经济有效的能够普遍开展的检测方法。

4 lncRNA导入HCC组织实现治疗的可行性

如前所述，众多lncRNA在细胞试验和动物试验中表现出了对HCC细胞恶性程度的抑制，且能够逆转肿瘤耐药，提示lncRNA可能成为新的靶向治疗位点。肝脏作为主要的代谢器官，具有显著的吸收外界治疗药物的能力，如有高效的干预方法，则有可行性。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）包括双链形式的小干扰RNA（siRNA）和单链形式的RNA，可在不同部位实现对目标RNA的剪切[46]，将其靶向导入肿瘤组织有多种方式。（1）将化学基团与ASO偶联，如胆固醇分子与ASO结合可增强肝细胞对其的吸收[47]。（2）通过脂质体介导：Sato等[48]利用维生素A偶联脂质体系统将靶向胶原伴侣gp46的ASO引入大鼠肝星状细胞，以抑制肝硬化。（3）类脂纳米颗粒[49]。（4）细胞外囊泡[50]。还有一种思路是将抑制肿瘤发展的lncRNA导入细胞使其过表达。基于AAV的核酸输送方法被誉为目前模式生物组织输送核酸的金标准，但也存在受限于lncRNA分子大小和病毒安全性的缺点，这方面的研究仍在起步阶段[51]。lncRNA的生物学作用已得到证实，目前对lncRNA的干预多停留在实验室水平，开发出更加高效的给药方法是实现治疗目的关键。

5 小结与展望

目前，早期肝癌的治疗以外科手术为主，进展期多无法手术而采取综合治疗，肝癌患者总体的生存时间仍很短。lncRNA是近年来的研究热点，可通过染色质修饰、结合并调节下游的RNA聚合酶、蛋白、miRNA等多种方法发挥生物学作用。本文阐述了lncRNA的基本作用方式及其对HCC的影响和机制。一些在HCC中特异性表达的lncRNA，能够参与调控肿瘤的增殖和侵袭能力以及血管生成能力，也能够调节肿瘤耐药性和干细胞特性。这种生物学作用使得lncRNA有望成为新型的肿瘤标志物以及治疗靶点，但仍需要大规模的临床研究加以验证。实现临床转化是最终目标，目前亟待解决的问题是明确灵敏度和特异度均合适的lncRNA以及发掘更好的RNA测序方法实现高效检验。同时在治疗层面，需要发掘靶向性强、效率高、相对安全的导入ASO的办法。总而言之，lncRNA是应对包括肝癌在内的多种恶性肿瘤的可能解决方案。