软骨细胞与间充质干细胞诱导成软骨肥大分化的调控机制及策略

靳泽怡 丁彩琳 于睿 闫继红

作者单位： 100069 首都医科大学基础医学院长学制临床医学专业(靳泽怡)；100045首都医科大学附属北京儿童医院(丁彩琳)；100069首都医科大学基础医学院 人体解剖与组织胚胎学系组织胚胎学教研室(于睿、闫继红)

软骨肥大分化是应用间充质干细胞(bone mesenchymal stem,MSCs)治疗软骨损伤修复的面临的一个难题。软骨肥大分化在骨关节炎中也经常会出现。如何抑制软骨肥大是应用MSCs进行软骨修复以及治疗骨关节炎亟待解决的问题。MSCs是一种具有多向分化潜能的细胞，能够在体内或体外分化成多种细胞，包括骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞等多种功能性细胞。在MSCs向软骨分化过程中，首先是MSCs聚集，依次分化为前软骨细胞和软骨细胞；后期分化为肥大软骨细胞分泌CollagenX胶原。这对维持稳定的软骨细胞表型是不利的[1]。现对软骨细胞肥大分化以及间充质干细胞来源的软骨细胞肥大分化进行概述并提出防止MSCs成软骨肥大分化有关策略。

一、调控机制

1.WNT信号通路：WNT信号通路是进化上高度保守的信号通路，在胚胎发育、维持稳态、生长发育以及一系列疾病的发生发展过程中有决定性作用。目前已经发现了3种不同的细胞内信号级联反应通路，包括经典WNT/β-连环蛋白通路、c-Jun N-末端激酶(c-jun kinase enzyme,JNK)通路和WNT/Ca2+通路。该信号通路在在不同的分化时期，即有刺激软骨细胞肥大的功能，也有成软骨分化的功能；即在成软骨分化的早期，Wnt/β-连环蛋白信号通路可促进软骨形成；而在成软骨分化的晚期，Wnt/β-连环蛋白信号通路在促进软骨形成的同时进一步加速软骨细胞的肥大与成熟[2]。(1)经典WNT/β-连环蛋白通路：经典WNT/β-连环蛋白通路由聚积在细胞核的β-连环蛋白介导，与软骨细胞肥大密切相关。当WNT信号未激活时，酪氨酸激酶1(casein kinase-1,CK-1)能将β-连环蛋白磷酸化。随后轴蛋白(axin)使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)靠拢β-连环蛋白，并将β-连环蛋白磷酸化；最终GSK-3β、CK-1、β-连环蛋白和多发性结肠腺瘤(APC)蛋白结合在一起构成β-连环蛋白降解复合物。β-连环蛋白受到泛素化修饰，被蛋白酶体降解，造成细胞内β-连环蛋白的减少，使得WNT调控靶基因不能表达[3]。当WNT与卷曲蛋白(frizzled,Fzd)结合后会激活下游信号分子散乱蛋白(dishevelled,Dvl)。Dvl能破坏β-连环蛋白降解复合物，从而使未磷酸化的β-连环蛋白在胞质中积累。β-连环蛋白进入细胞核内，在细胞核中，β-连环蛋白与T细胞特异性因子(T lymphocyte specific factor,TCF)/淋巴增强子结合蛋白(lymphoid enhancer-binding factor,LEF)转录因子形成复合物。LEF/TCF/β-连环蛋白可激活靶基因的转录，即促进诱发肥大的RUNX2的表达。SOX9可通过促进β-连环蛋白的磷酸化抑制这种信号[3]。研究证实[4-5]，SOX9和RUNX2基因蛋白表达程度决定了经典WNT信号通路对软骨细胞肥大进程的影响。即在软骨内，WNT的适度激活对于软骨细胞增殖是必要的，而过度激活则会增加软骨细胞的肥大和基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinase,MMP)13的表达，进而促进软骨细胞的肥大分化进而骨化。(2)非经典WNT信号通路：非经典WNT信号通路(如WNT5a信号通路)通常仅在软骨细胞形成和分化的早期阶段诱导软骨细胞的肥大。在早期阶段，WNT5a通过细胞内经G蛋白偶联受体激活磷脂酶C进而释放第二信使，使Ca2+通道开放，释放Ca2+诱导软骨形成和肥大[6]。而在后期，虽然WNT5a可以通过依赖激活依赖磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PKB或Akt)通路作为肥大抑制剂，进而激活核因子-κB，抑制RUNX2的表达，而抑制肥大的出现[7]。即非经典WNT信号通路(如WNT5a信号通路)在MSC软骨生成中表现出双重功能。

2.骨形态发生蛋白(bone morphogenotic protein,BMP)/转化生长因子-β(TGF-β)信号通路：BMPs是一组多功能的细胞因子，属于TGF-β家族。转化生长因子-β家族是一组多功能生长因子，参与细胞生长分化、免疫调节、胚胎发育和细胞凋亡等多种生理过程。(1)BMP信号通路：BMPs在胚胎骨骼发育过程中具有多重作用，除了具有促进MSCs聚集和诱导软骨形成分化外，BMPs还可诱导早期软骨形成，并且是软骨细胞增殖和软骨内骨化过程中成熟的关键因素。BMPs对MSC软骨细胞具有重要的调节作用，对软骨细胞肥大既有刺激作用又有抑制作用。例如BMP2和BMP4能诱导软骨细胞肥大，而BMP7能保持软骨形成潜力并抑制软骨细胞肥大[8]。在软骨细胞内，BMP信号通路对肥大的抑制过程基本由BMP- Mad相关蛋白(Smad)通路介导。当BMPs(BMP2/4)结合到受体BMPR-I和II，BMP通路被激活，使Smad1，Smad5和Smad8等受体依赖型Smad(R-Smads)磷酸化[9]。R-Smads磷酸化后招募通用型Smad(Co-Smad，即Smad4)并与其结合形成异聚体转运到细胞核中，随后结合到靶基因RUNX2的调控区以调节RUNX2的表达[9]，并伴有如X型胶原、MMP13和ALPL等肥大标记物的表达[10]。(2) TGF-β信号通路：在体外，TGF-β是一种软骨生成的强诱导剂，即TGF-β信号通路可刺激软骨细胞增殖分化并抑制软骨细胞肥大。 TGF-β通过Smad2/3信号通路抑制软骨细胞的终末肥大分化并稳定软骨形态[11-12]。Smad2/3途径被TGF-β直接活化，其作用途径为：TGF-β受体(tromsforming growth factor-β receptor,TGFβ-R)与TGF-β结合后聚合并自身磷酸化，进而募集并磷酸化Smad2和Smad3；磷酸化的Smad2/3与Smad4形成三聚体后转移至细胞核内；随后，该Smad三聚体复合物调控SOX9转录抑制RUNX2表达，从而诱导软骨生成并抑制软骨细胞肥大[13-14]。

3.甲状旁腺素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)/印度刺猬因子(Indian hedgehog,IHH)信号通路：(1)IHH信号通路： IHH属于在hedgehog信号传导途径的一部分。它在软骨细胞分化、增殖和成熟等过程，特别是在软骨内骨化过程中均具有重要作用。IHH通常通过反馈控制甲状旁腺激素相关蛋白来调节其作用，但也可直接导致软骨细胞肥大。IHH在与其受体Ptch1结合后，可通过其下游转录因子GLI-K家族成员(Gli)1/2促进RUNX2/Smad之间的相互作用，进而促使X型胶原的转录和表达等软骨细胞肥大表型的出现[15]。(2)甲状旁腺素相关蛋白信号通路：甲状旁腺素相关蛋白属于甲状旁腺激素家族，是抑制软骨细胞肥大的关键因素之一。其受体PTH1R为G蛋白偶联受体。实验结果表明，甲状旁腺素相关蛋白或PTH1R敲除的小鼠会导致小鼠软骨细胞肥大加速[16]。细胞内介导甲状旁腺素相关蛋白信号的方式主要包括激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)或蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)，或激活NK3同源框2(NK3 homebox protein2,NKx3.2)，也可通过钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca+2/calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)的去磷酸化干扰钙途径。PKA介导PTHrP信号过程为PTHrP与PTH1R结合后，依次激活环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A，进而一条信号通路直接磷酸化SOX9；而另一条信号通路激活蛋白磷酸Ⅱ(protein phosphatase 2A,PP2A)，导致组蛋白脱乙酰4(histone deacetylase 4,HDAC4)去磷酸化以及转录因子MEF2C和RUNX2的失活，从而抑制相关肥大基因的表达[17]。PTHrP信号与Ca2+信号之间的关系是，PTH/甲状旁腺素相关蛋白信号传导和Ca2+水平之间存在反馈回路。p38MAPK位于PTH/甲状旁腺素相关蛋白信号通路的中心，即可通过连接上游的PKC和下游的Bcl-2来调控软骨细胞肥大[18]。PTH/甲状旁腺素相关蛋白具有抑制p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的活性的作用，抑制软骨细胞肥大[18]。因此，有研究则通过在对MSC进行软骨诱导中加入PTHrP的4种同分异构体后发现甲状旁腺素相关蛋白1-34显著增加了Ⅱ型胶原的表达且减少了肥大标志物[19]。

4.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)信号通路：FGF属于细胞信号传导蛋白家族，FGF信号通路在调控软骨细胞分化过程中有重要作用[20]。 FGF家族中的4个成员包括FGF2、FGF8、FGF9和FGF18，均是影响软骨内环境稳定的因素[20-24]。其中，FGF2通常在增殖和肥大前软骨细胞、骨膜细胞和成骨细胞中表达，其功能在于促进RUNX2的表达[25]。在人类关节软骨细胞，FGF2与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)1结合后激活PKC8，通过Raf-MEK1/2-ERK1/2级联反应向细胞核内传递信号，进而促进RUNX2的表达[26]。FGF9的作用机制仍存在争议。FGF9可在骨骼发育的早期阶段促进软骨细胞肥大[23]。FGF18在肥大软骨细胞中通过传递信号给FGFR1和FGFR2，通过Raf-MEK1/2-ERK1/2级联反应向细胞核内传递信号，促进RUNX2的表达，进而诱导如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等肥大标记物的表达[27]。此外，FGF信号通路与WNT、IHH和BMP等信号通路之间均存在着相互作用关系，并且对MSCs的命运及随后软骨细胞的肥大成熟等过程起到重要的作用[28]。如FGF与FGFR1结合后，可作用于WNT通路下游的β-连环蛋白、以及与FGF信号通路存在着拮抗关系的IHH的信号通路和与FGF信号通路存在着协同关系的BMP通路，从而促进肥大软骨细胞成熟等[28-30]。

5.胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)信号通路： IGF-1具有促进软骨细胞增殖和成熟的功能，同时对骨骼发育具有重要作用，常表达于生长板软骨细胞增殖和前肥大区域[31]。生长发育过程中IGF-1介导的成骨成软骨分化过程，是通过改变软骨细胞增殖与肥大之间的平衡关系而相互协调[32]。对于MSCs而言，IGF-1能诱导MSCs进行分化形成软骨细胞，前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞[33]。IGF-1信号在调控生长板软骨细胞肥大过程是通过调控WNT/β-连环蛋白信号传导途径而实现的[34]。在肥大软骨细胞中，IGF-1和IGF-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF1R)结合后可刺激生长板软骨细胞中的Wnt4表达和激活β-连环蛋白，进而通过该信号通路作用于RUNX2等相应的肥大标记物[35]。

6.Notch信号通路：Notch信号通路是一条在进化上极具保守,影响细胞命运的信号传导途径，该通路对整个软骨形成过程和维持软骨细胞的表型,调控软骨细胞的增殖,成熟,肥大化等方面均发挥重要的作用。Dong 等[36]研究还证明如果软骨细胞中的 Notch 信号得到抑制，将会引起软骨细胞的增殖和肥大。Notch信号通路在对软骨细胞分化的三个不同阶段都扮演了一个重要角色。Hayes等[37]在小鼠的生长发育过程中的研究表明，在关节软骨深层和骨骼生长板的肥大细胞中可发现Notch3 受体的特定性表达。

7.MAPK信号通路：MAPKs在有关细胞增殖、分化和凋亡等多种信号通路中发挥关键作用[38]。Erk1/2 MAPK通路可被生长因子激活，JNK/p38 MAPK通路可在细胞应激、缺氧等条件或细胞因子的作用下而激活[39-40]。通过单独添加PTH、SB203580或同时使用两者，可抑制肥大软骨细胞中的p38MAPK，导致COL10A1 mRNA的减少和肥大前标志物软骨基质蛋白表达的增加。因此，抑制p38可使细胞从肥大细胞表型转变为肥大前细胞表型，从而阻止软骨细胞过早肥大[41-42]。Erk1/2信号通路的激活促进软骨细胞肥大[43-44]。TGF-α是表皮生长因子受体信号传导的激活因子，其在人骨关节炎的关节软骨细胞中表达；抑制MEK/ERK可大大减少或完全阻止TGF-α引起Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖降解[45]。

8.整合素信号通路：整合素可通过参与MAPK信号通路，进而调节软骨肥大过程。整合素α5β1表达上调后，RhoA蛋白表达随之升高，进而促进下游MAPK-ERK蛋白表达与活化，激活MAPK经典信号通路，最终引起RUNX2的mRNA与蛋白表达水平升高[46-47]。

二、抑制软骨细胞肥大分化的策略

1.小分子蛋白抑制剂：由于相关信号通路参与软骨肥大分化，因此，可以通过阻断或者激活相关信号通路来抑制肥大分化。Smad1/5/8途径的磷酸化可诱导软骨细胞的肥大，因此，在培养基中通过添加Smad1/5/8途径抑制剂dorsomorphin在一定程度上能暂时抑制软骨的肥大分化，促进软骨形成[48]。有研究表明，同时添加FGF2与甲状旁腺素相关蛋白信号通路可抑制软骨细胞肥大分化[49]。在含有FGF18的成骨培养基中培养MC3T3-E1细胞，ALP活性明显降低，成骨相关基因包括ALP、Colla1、骨钙蛋白、骨唾液蛋白等的表达明显被抑制。同时，该细胞的矿物质沉积也明显降低[49]。由此可知，可通过添加FGF18激活FGF信号通路可抑制肥大分化。已知BMP4位于Notch通路上游，并通过Notch通路抑制成软骨分化过程而促进肥大分化，因而可通过添加相应阻断剂如Notch通路抑制DAPT和BMP信号通路的阻断剂等来抑制软骨肥大过程[50]。由于MAPK和整合素信号通路也与软骨肥大分化相关，因此，可通过抑制p38 MAPK和Erk1/2以及整合素途径以抑制软骨细胞肥大以维持软骨分化表型。研究已经证实[51]甲状旁腺激素相关蛋白可以抑制软骨肥大分化[51]。缺氧条件下可以诱导甲状旁腺激素相关蛋白产生进而可通过减少肥大软骨产生而获得表型稳定的软骨组织。因此，在未来临床应用时，可考虑将体外缺氧环境适当转化为体内环境，以促进与天然关节软骨相似的软骨的形成。

2．支架材料：不仅可针对一些转录因子及相关信号通路进行调控以抑制软骨肥大化，组织工程支架材料的应用也提供新的思路[52-53]。在体外，将 MSC种植在支架上进行向软骨方向诱导，构建的MSC-mECM支架复合物，可表现出与天然软骨相似的软骨形态，并且肥大化标志物也明显减少。很多研究表明，MSC种植在支架上，可以更好的发挥MSC软骨分化作用。有研究发现，包裹在光交联产生的新型透明质酸水凝胶中的MSCs可以产生更多的II型胶原蛋白和硫酸软骨素，而I型胶原蛋白的沉积较少, 从而形成良好的软骨组织[54-55]。因此，把 MSCs种植在支架上可以通过减少软骨肥大分化以起到软骨缺损修复的作用。

在体外获得表型稳定的软骨细胞是软骨组织工程应用的首先的环节。通过阐明MSC或软骨肥大分化调控机制，以便进一步探究如何建立起适当的信号平衡以及抑制肥大分化作用的分子靶点，为精准地调控MSCs定向软骨分化，维持表型稳定，推进MSCs作为种子细胞在软骨组织工程中的应用奠定基础。