基因编辑技术在疾病中的应用及研究进展

董田玉 刘远远 段思琦 付雪瑞 常彦忠

1河北医科大学解剖教研室,石家庄050017;2河北师范大学铁代谢分子生物学研究室,石家庄050024;3河北医科大学期刊社,石家庄050017;4河北医科大学大型科研仪器设备共享服务平台,石家庄050017

基因编辑技术主要包括锌指核酸酶 (zinc finger nucleases,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALEN)、规律性重复短回文序列簇 (clustered regularly interspaced short palindro mic repeats/cas endonuclease,CRISPR/Cas)系统。近年来,CRISPR/Cas系统在基因工程领域取得了重要突破。该项技术虽然研究时间不长,但在生物研究和医学领域产生了重大影响。在人类疾病中,呼吸系统类疾病高居癌症死亡率之首,科学家利用CRISPR/Cas基因编辑技术在治疗肺癌等疾病中进行了深入研究,并获得重大突破。本文重点介绍了近年来基因编辑技术及其在呼吸系统等疾病中应用及其研究进展。

1 基因编辑技术

1.1 ZFN 编辑技术 锌指蛋白是上世纪80年代由科学家在非洲爪蟾的转录因子中发现,后逐步发展完善成为较早的一类人工编辑基因组的技术[1]。ZFN 由特异识别DNA的锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域两部分构成,是一种人工合成的融合蛋白。将人工设计产生的锌指蛋白与非特异性FokⅠ剪切结构域结合形成具有活性的二聚体,即可对目标基因进行特异剪切。ZFN 作为第一代被广泛使用的基因剪切工具,在小鼠、大鼠、斑马鱼及人类细胞中的技术建立已经较为成熟。2003年,科学家成功地利用该技术对果蝇和人类细胞的基因进行编辑[2]。但是由于ZFN的设计复杂,构建时间长并且成功率低,不能广泛的被实验室掌握,因此该技术的发展与应用在一定程度上受到了阻碍。

1.2 TALEN 技术 随着对基因编辑技术的深入研究,TALEN 技术逐渐取代了ZFN 技术,成为第二代基因编辑技术[3]。TALENs 核酸酶是由特异识别结合DNA 的TALE蛋白和FokⅠ核酸内切酶融合组成。TALE 蛋白是一类从植物病原菌黄单胞菌属分离出的效应蛋白,识别靶标序列,同样地利用限制性核酸内切酶FokⅠ对基因组进行编辑。2009年,Moscou和Bogdanove[4]发现了TALE蛋白特异识别并结合DNA 的作用机制。2011 年,Sander等[5]将改造的Tale 蛋白与FokⅠ核酸内切酶构建了TALEN 技术,并证实其能定向修饰基因组。此后,有大量实验证明该技术在人类细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼等不同物种均适用[5]。与ZFN 相比,在识别靶序列的特异性上,TALEN 更具优势。此外,TALEN 的毒性低,蛋白设计也相对简单,因而成为基因治疗研究中的有力工具。但是,其重复序列多,工作量大,在实验室广泛应用仍存在困难。

1.3 CRISPR/Cas技术 CRISPR/Cas技术是第三代基因编辑技术,开启了基因编辑技术领域的新篇章[6]。CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫系统,通过靶向DNA或RNA 来保护微生物免受外来核酸 (如噬菌体)的侵袭,约50%的细菌种类和迄今为止几乎所有的古细菌物种都有这种系统[7]。该系统的显著特征是在基因组上含有CRISPRarray序列,由富含AT 的前导序列和串联重复序列组成,这些串联重复序列又被序列特异的间隔隔开。CRISPR/Cas系统抵抗外源DNA 入侵。CRISPR/Cas系统通过三个阶段介导适应性免疫 (免疫和防御)[8]:首先,适应阶段,当病毒或其他外来遗传物质入侵时,细菌将部分外源的DNA 捕获并整合到CRISPR array的串联重复序列中,形成新的间隔序列。其次,表达阶段,将CRISPR array转录并加工成单独的cr RNA,每个cr RNA 带有病毒或质粒的RNA 片段以及CRISPR 重复序列的一部分成为成熟的cr RNA。第三,干扰阶段,cr RNA 引导Cas蛋白的复合物或单个Cas蛋白对入侵者进行切割,最终达到免疫的效果。

CRISPR 有很多变化,而且CRISPR/Cas系统也具有广泛的自然多样性,包括靶向DNA 的系统、靶向RNA 的系统以及同时靶向DNA 和RNA 的系统。CRISPR/Cas系统也以不同的方式运行,通过各种效应子-cr RNA 复合物介导的不同机制识别和切割其核酸靶点。根据其独特的效应蛋白,CRISPR/Cas系统目前分为6种类型 (Ⅰ～Ⅵ),又分为两大类:1类系统 (TypeⅠ、TypeⅢ和TypeⅣ型)使用多个Cas蛋白复合物来实现免疫应答,2类系统 (TypeⅡ、TypeⅤ和TypeⅥ型)利用单个核酸酶Cas效应子进行免疫应答[9-10]。例如属于TypeⅡ型系统的Cas9,只需要Cas9蛋白即可与成熟的cr RNA 组装成RNP复合物对DNA 进行切割[11-12]。2013 年,CRISPR/Cas技术正式用于DNA 编辑修饰中[13]。与前两种基因编辑技术相比,该技术的构建成本更低、操作更加便捷、编辑效率也更高效。其不断地研究发现为生物学及临床应用领域的发展带来了巨大变革,在基因治疗领域具有广阔的应用前景。

2 基因编辑技术在疾病中的应用

2.1 疾病模型中的应用 CRISPR/Cas9技术对生物学研究发展最直接的影响之一是建立植物、动物和细胞模型。首先,因为CRISPR/Cas9技术极大地减少了修改传统真核生物模型和细胞系基因组所需的时间和精力 (酵母除外,对于酵母而言,已有数十年的强大基因操作工具)。其中一个关键的例子是基因敲除小鼠的产生。在2013年之前,基因敲除小鼠是用改良的胚胎干细胞制造的,整个过程需要1～2年,而Cas9介导的基因敲除可以在几周到几个月内完成[14-15]。最近,有学者提出可以通过使用Cas9介导的基因驱动方法来进一步加速定制小鼠模型的产生[16]。这种方法也适用于创建非人类灵长类动物模型[17]。同样,CRISPR 工具易于重新编程,使其得以大规模应用,从而快速创建细胞系库。其次,CRISPR/Cas9技术可以容易地处理多种其他生物的基因,包括寄生虫、微生物和非模型生物[18],例如甲壳类动物[19]、黄蜂[20]、蝴蝶[21]和硅藻[22]。第三,CRISPR/Cas9技术被用于创建特定的动物和细胞模型,以重现在人类患者发现的基因变异[23]。这些特定的模型使疾病模型更加精确,可用于了解一系列人类疾病的分子病理学,并开发新的治疗策略来治疗这些疾病。例如,通过Cas9介导的基因编辑创建了亨廷顿舞蹈症的猪模型,从而可以在相关的动物模型中研究这种疾病[24]。第四,Cas9可在体内加速构建疾病模型,例如癌症[25-26]。此外,已经创建了d Cas9-EGFP 敲入小鼠,可以轻松、动态地跟踪目标基因组区域[27]。利用这些小鼠模型,研究人员可以更容易地在特定的细胞类型中实现多个基因敲除,更快地为疾病建模,从而研究多种生物学过程,包括癌症、伤口愈合[28]、突触传递[29]、昼夜节律[30]和T 细胞分化[31]等。

2.2 呼吸系统疾病治疗中的应用 氧化应激可导致肺纤维化引起呼吸疾病[32]。通过CRISPR/Cas9 技术在细胞实验中已证明低聚原花色素对非小细胞肺癌细胞 (A549)中过氧化氢诱导的氧化应激起到保护作用。实验发现,低聚原花色素刺激的A549细胞中改变了Nrf2的表达。Nrf2是对氧化还原反应敏感的转录因子,可以引起其下游靶基因在转录水平和蛋白质水平上的变化。通过CRISPR/Cas9技术敲除Nrf2可以消除Nrf2与抗氧化反应元件ARE 的结合,从而消除了低聚原花色素介导的针对过氧化氢诱导的氧化应激的保护作用[33]。研究表明在A549细胞的抗氧化反应中低聚原花色素通过Nrf2-ARE 途径起重要作用,这项研究为呼吸疾病的治疗提供了理论依据[34]。

而且在临床试验中CRISPR/Cas9技术已经开始作为肺癌的干预手段。该试验主要对PD-1 的功能进行了研究。PD-1只能在活化的T 细胞中表达,该基因可促进细胞的凋亡,是临床上的一个免疫检查点。当PD-1被敲除时会延长T 细胞的存活时间,这是因为T 细胞周期检查点被抑制所导致,引起活化的T 细胞的存活时间延长。通过CRISPR/Cas9技术敲除PD-1基因后,血液中活化的具有免疫功能的T 细胞数量明显增加,以此来抑制肿瘤生长[35]。此次试验中,通过收集病患自体来源的T 细胞 (外周血液中),利用CRISPR/Cas9技术将PD-1基因敲除而丧失基因功能,再通过扩增筛选出已敲除PD-1的T 淋巴细胞,并将其分批回输患者身体中,通过观察临床效果发现敲除PD-1基因对肺癌有抑制作用[36]。

2.3 AIDS和白血病治疗中的应用 CRISPR/Cas9技术已广泛应用于哺乳动物细胞基因组的体外编辑。尽管这种方法显示出潜在的临床实用性,并且已经开始进行临床试验以探索基于CRISPR 疗法的安全性和可行性[37]。有研究表明,G 蛋白偶联因子超家族成员CCR5基因是治疗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 (hu man i mmunodeficiency vir us type 1,HIV-1)感染的理想靶点,因为CCR5 缺失的血细胞对HIV-1进入具有很大的抗性[38]。2019 年,Xu 等[39]利用CRISPR/Cas9技术,在人体造血干细胞上进行CCR5基因编辑,实现了基因编辑后的成体造血干细胞在人体长期稳定的造血系统重建,初步证明了CRISPR/Cas9治疗AIDS和白血病的可行性和在人体内的安全性。该研究将经CRISPR/Cas9编辑的CCR5敲除后的供者来源的CD34+成体造血干细胞移植到患有HIV-1感染和急性淋巴细胞白血病的患者中。在之后19个月的观察中未发现基因编辑造成的脱靶及其他不良反应。之后为了进一步探索治疗的有效性,对该患者短暂停止服用抗人类免疫缺陷病毒药物。在此期间,CCR5基因编辑的T 细胞表现出一定程度抵御人类免疫缺陷病毒感染的能力。目前,虽然人们已经实现了CRISPR 编辑的造血干细胞的成功移植和长期植入,但淋巴细胞中CCR5破坏率仅约为5%,这表明还需要进一步进行研究。

2.4 其他疾病治疗中的应用 基因编辑技术在治疗其他多种疾病上也取得了重要的研究进展。2018 年,Long等[40]利用CRISPR/Cas9技术对杜氏肌营养不良症患者机体的多能干细胞进行改造,使其产生了健康的心肌。2017 年,Liao等[41]报道利用CRISPR/Cas9在糖尿病小鼠体内募集转录激活复合物,实现顺式表观遗传学修饰,介导基因转录活化的组蛋白修饰状态,从而实现内源基因的激活。利用该体系可在肝脏内成功激活内源PDX1表达,使其分泌胰岛素。Chen等[42]发现,酸敏感离子通道1 参与了前列腺癌细胞酸介导的信号通路,并且在前列腺癌细胞中表达升高,通过CRISPR/Cas9系统敲除酸敏感离子通道1可以显著降低前列腺癌细胞的侵袭能力和去势抵抗性。汪超甲等[43]利用CRISPR/Cas9表达载体敲除了在神经胶质瘤细胞中高表达的Pyk2,抑制了胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,揭示了其在胶质瘤发生过程中的作用,为治疗胶质瘤提供了理论基础。Rubio等[44]利用CRISPR/Cas9系统在干细胞中针对神经系统疾病相关基因TSC2 与KCNQ2进行靶向灭活。TSC2与结节性脑硬化相关,KCNQ2与家族性先天性癫痫有关[45]。

3 问题与展望

CRISPR 系统介导的基因编辑技术出现以来,就在生物医学等诸多领域产生了深远的影响,但目前该技术在临床治疗应用中仍然存在一些问题,如有效性问题。我们知道基因编辑体系依赖于外源编辑酶或效应蛋白的表达,而蛋白分子量过大会很难通过病毒载体进行装载以及人体内递送,并且蛋白过表达引起的DNA/RNA 水平的脱靶效应、机体内的抗体中和外源编辑酶或效应蛋白都会导致基因编辑失败。此外,还存在由外源蛋白表达引起的机体免疫反应及排斥的安全性问题。除了这些技术问题,伦理问题也不容忽视。2018年,有研究者跨过人类胚胎基因编辑技术的体外试验阶段,对2名志愿者在胚胎上进行基因编辑并植入母体,其中1名已经产下双胞胎女婴,由于这对双胞胎的一个基因 (CCR5)经过修改,她们出生后即能天然抵抗人类免疫缺陷病毒[46]。这一事件一经宣布,立即引起了世界的关注,科学家们对此事更多的是质疑和负面评价。

随着科学家研究的不断深入探索,基因编辑技术正在走向成熟。基因编辑技术已经在基础科研和临床应用中取得了重大突破与进展,具有极大的研究潜力和广阔的应用前景,将会使我们对疾病机制的理解、对生物基因网络的认识更加清楚。尽管目前对于基因治疗还有许多技术难题需要解决,但我们可以相信随着人类基因表达调控机制的阐明,以及转基因方法的完善,基因编辑技术会在临床疾病治疗中发挥其不可替代的价值。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突