新型冠状病毒病原学特点和诊断方法的研究进展

魏家豪 王自栋 阎锡新

河北医科大学第二医院呼吸与危重症医学一科,石家庄050000

新型冠状病毒具有较强的传播性[1]。同属冠状病毒的严重急性呼吸综合征冠状病毒 (severe acute respiratory syndro me coronavirus,SARS-Co V)和中东呼吸系统综合征 冠 状 病 毒 (Middle East respirator y syndr o me cor onavir us,MERS-Co V)能够引起严重急性呼吸综合征和中东呼吸系统综合征,曾分别在2002年和2012年出现并造成流行。SARS-Co V 造成8 096例感染和774 例死亡[2],MERS-Co V 造成2 494例感染和858例死亡[3]。2020年2月11日,WHO 宣布将新型冠状病毒感染所致疾病正式命名为COVID-19,同时国际病毒分类学委员会又将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndro me cor onavir us 2,SARSCo V-2),并认定其是SARS-Co V 的姊妹病毒。COVID-19患者的病情严重程度差异较大,临床表现亦无明显特异性。轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等症状,无肺炎表现,而重症病例可出现呼吸困难或低氧血症,严重者可快速进展为ARDS、脓毒症、休克及多器官功能障碍综合征,甚至死亡。

WHO 分 别 于2020 年1 月30 日 和3 月11 日 宣 布COVID-19为突发公共卫生事件和世界大流行。截至2021年3月27日,全球累计确诊病例1.2亿余例,死亡病例逾270万。疫情期间,SARS-Co V-2的病原学研究不断开展,使得研究人员对病原体的认识不断丰富。研究人员根据病原学特点和疾病特征开发出新的诊断方法,从疫情初期应用的基因测序,逐渐发展出PCR、以影像学为主的临床诊断方法和血清学试验,使得对确诊病例诊断的敏感性不断提高。通过科学的诊断、规范的治疗和精准的防控,国内疫情历经几次波折后目前已得到控制,但境外疫情仍持续扩散蔓延。

1 病原学

COVID-19疫情暴发初期,多家研究机构相继在患者支气管肺泡灌洗液中采集病毒并进行分离和培养,完成了病毒的全基因组测序[1,4-7],获取了病毒的详细信息,并对已知的病毒信息进行对比。

1.1 SARS-Co V-2的分类 SARS-Co V-2与SARS-Co V 均属于β冠状病毒的sar becovir us亚属,是一种单正链RNA病毒,其基因全长约为29 900个碱基对,有较高的突变率。多家研究机构通过基因同源性检索发现SARS-Co V-2与β冠状病毒属的SARS 样冠状病毒密切相关,SARS-Co V-2和bat-SL-Co VZC45、bat-SL-Co VZXC21、Pangolin-Co V 及Ra TG13的全基因组序列一致性分别为87.99%、87.23%、91.02% 及96.2%, 而 SARS-Co V-2 同 SARS-Co V 和MERS-Co V 的序列一致性仅约为79%和50%[4-8]。

1.2 SARS-Co V-2的形态和结构 中国疾病预防控制中心通过透射式电子显微镜发现,SARS-Co V-2 常呈球形或椭圆形,也可为多形性,直径约为60～140 n m,表面有很多长度约9～12 n m 的刺突蛋白[6]。

SARS-Co V-2基因编码非结构蛋白和4 种结构蛋白,结构蛋白分别为刺突蛋白 (S)、病毒包膜 (E)、基质蛋白(M)和核蛋白 (N)[9]。非结构蛋白主要由其基因组中的开放阅读框1ab (open reading frame 1ab,ORF1ab)编码,其中RNA 依赖的RNA 聚合酶负责病毒RNA 的合成,而主蛋白酶则是参与蛋白质加工的关键酶,二者是病毒复制中重要的非结构蛋白,因此成为抗病毒药物的重要靶点[10-11]。上述蛋白的相应基因在SARS-Co V-2基因组中自5'端开始的顺序为ORF1ab、S、E、M 和N,这些蛋白对应的核酸碱基序列经常作为PCR 检测的靶点。

SARS-Co V-2包膜上的S蛋白介导受体结合和膜融合,在决定病毒的嗜性和传播能力方面起到关键作用,也是中和型抗体的重要靶点和疫苗设计的关键位点[4,12-13]。其中,S蛋白在功能上通常分为S1亚基和S2亚基,S1亚基负责识别和结合细胞表面受体,S2 亚基负责细胞膜融合。SARS-Co V-2和SARS-Co V 的S蛋白受体结合区域的结构具有相似性,共同使用血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzy me 2,ACE2)作为细胞受体,并且Zhou等[1]和Walls等[12]的体外实验和血清学试验也支持这种可能性。但SARS-Co V-2和SARS-Co V 的S蛋白某些氨基酸残基不同,导致两者的S 蛋白和ACE2 的亲和力也不同。疫情早期,Shang 等[13]和Wrapp 等[14]的研究数据表明SARS-Co V-2的S蛋白对人ACE2 的亲和力更高,而且S蛋白对人ACE2的高亲和力可能促进了SARS-Co V-2在人群中的传播。此后,Kor ber 等[15]的研究进一步发现,SARS-Co V-2的S蛋白S1 亚基D614G 位点突变增强了病毒的传播性。N 蛋白与病毒RNA 结合形成核糖核酸蛋白;E蛋白参与了病毒的组装和出芽,并参与离子通道的形成,M 蛋白也参与了病毒颗粒的组装。此外,Sun等[16]通过酶联免疫吸附试验证实病毒S蛋白和N 蛋白都能够诱导产生特异性抗体,其中Ig G 和Ig M 的血清学测定能够用于COVID-19的诊断和预后的评估。

1.3 SARS-Co V-2的致病机制 SARS-Co V-2通过S蛋白侵入细胞,而肺脏内的ACE2主要表达在Ⅱ型肺泡上皮细胞[17]。SARS-Co V-2通过ACE2侵入组织后,中性粒细胞和单核/巨噬细胞等固有免疫细胞渗出,此外重症患者体内的多种免疫细胞还可以产生大量促炎性细胞因子,引起“细胞因子风暴”,促进了ARDS的发生[18-19]。Blanco-Melo等[20]进行的体外实验、动物实验和临床研究也显示病毒复制诱导了趋化因子和IL-6等细胞因子高表达;SARS-Co V-2的基因产物抑制了宿主生成IFN-1和IFN-2的反应性,导致免疫应答受阻,致使病毒的高复制难以得到控制。其中,伴有基础疾病和高龄等免疫力低下患者容易发展为重症病例可能与此有关。Huang等[21]的临床研究为上述观点提供了依据,他们发现患者的IL-2、IL-7、IL-10、粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α等细胞因子都可以升高,而且重症患者血浆中的促炎性细胞因子水平往往较非重症患者高。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案 (试行第七版)》[22]开始把外周血IL-6和C-反应蛋白等外周血炎症因子作为在重型、危重型的临床预警指标。此外,口腔黏膜上皮细胞、食管复层上皮细胞、回肠和结肠的肠上皮细胞、胆管细胞、心肌细胞、肾近端小管细胞和膀胱尿路上皮细胞中均有ACE2的高表达,患者出现胃肠道症状和肝功能异常等表现,可能是由于病毒感染胃肠道和胆管上皮细胞引起功能障碍等原因所致。SARS-Co V-2 除感染人类之外,Shi等[23]通过研究发现白鼬和猫极易感染SARS-Co V-2,狗的易感性较低,而猪、鸡和鸭等畜禽则不易感染SARS-Co V-2。

2 临床特征

COVID-19患者发病症状差异较大。疫情早期,由钟南山院士牵头的COVID-19高级专家组和中国疾病预防控制中心开展的两项临床研究[24-25]显示患者症状发生率相似,症状包括为发热 (88%)、干咳 (68%)、乏力 (38%)、咳痰 (34%)、气短 (19%)、肌痛或关节痛 (15%)、咽痛(14%)、头痛 (14%)、寒颤 (11%)、恶心呕吐 (5%)、腹泻 (4%)、鼻塞 (5%)、咯血 (1%)和结膜充血 (1%)等;在实验室检查中,淋巴细胞减少和C-反应蛋白升高常见,也可见血小板和白细胞减少。COVID-19 患者影像学表现常为磨玻璃样影、斑片状阴影、小叶间隔增厚及实变,累及双侧多个肺叶,多分布于背侧和外周[24,26]。COVID-19患者缺乏特异性临床表现,因此对疑似患者进行确诊往往还需要借助特异性实验室检查。

3 诊断方法演进

疾病快速诊断及无症状感染者的发现对于疫情的防控和救治至关重要。国内外机构围绕患者实验室诊断试验及患者影像学特征开展了大量研究。随着对病原学和疾病认识的加深,诊断方法最初从单一的基因测序,逐渐发展出了PCR、影像学方法为主的临床诊断和血清学试验。

3.1 基因测序 第二代基因测序技术 (next-generation sequencing,NGS)可以应用于感染性疾病的临床诊断,特别是在传统诊断方法受到制约和检测罕见微生物方面,NGS不仅能够对患者的临床样本进行微生物的检测和生物学分型,还能够在流行病学、进化追溯、易感因素预测、毒力和耐药性测定方面发挥作用[27]。

疫情初期,研究人员对新病原体的了解相对局限,缺乏SARS-Co V-2基因序列和引物等相关信息,NGS在病原体检测中发挥了重要作用。除确诊病例具备流行病学史和相应临床表现外,国内的研究往往先进行血清学试验或PCR 排除常见呼吸道病原体感染,然后应用NGS 进行病原学检测和诊断,测序结果需与SARS-Co V-2 高度同源[4-7]。而且,NGS与随后推广的PCR 技术对COVID-19的诊断具有良好的一致性,近期Papoutsis等[28]的一项小型研究结果显示,症状患者的粪便样本行全基因组NGS与鼻咽分泌物行PCR 的结果一致率为100%。此外,该研究在4例患者的NGS测序结果中检出33种不同的突变。但是在临床采集的样本中病毒核酸的含量较低,而宿主的基因片段占据了大部分,这种情况降低了NGS对病原体检测的敏感性。NGS在疫情初期能够快速地投放应用,在检测新发病原体方面获得了较为全面的病原学信息,但是NGS对样本和技术手段要求较高、流程较慢、耗资较高,难以在疫情暴发阶段大规模开展。然而,NGS在SARS-Co V-2毒株监测方面却举足轻重。Motayo等[29]通过对NGS测序结果进行分析,将SARS-Co V-2分为不同的谱系和亚谱系并简要描述了毒株的流行状况。

3.2 分子生物学实验 PCR 和NGS都属于分子生物学技术,能够为COVID-19的诊断提供病原学证据,其中PCR通过将特定的核酸片段进行指数式扩增,能够在不相关核酸较多的临床样本中检测出特定病原体的微量核酸,具有较高的敏感度。PCR 能够快速、经济、可靠地检测病毒核酸,完成一次PCR 和NGS分别耗时3 h和24 h[30]。

2020年1月21日,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所发布实时荧光RT-PCR 的引物和探针,选择SARS-Co V-2 ORF1ab和N 2个基因区域作为检测靶点[31]。1月23日,国家卫生健康委员会公开发布 《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案 (试行第三版)》[32],明确提出了疑似病例需同时具备流行病学史和相应临床特征,确诊病例需通过RT-PCR 或基因测序寻找病原学证据。此后,Peng等[33]发现患者血液、尿液和呼吸道及消化道标本等多种样本经PCR 检测呈阳性,并且后续版本的诊疗方案增加了血和粪便样本,并强调检测下呼吸道样本更为准确。这是因为患者不同类型的样本中的PCR 检测阳性率不同。Wang等[34]进行的一项多中心临床研究显示支气管肺泡灌洗液标本阳性率最高可达 (93%),其次痰 (72%)、鼻拭子(63%)、纤维支气管镜刷检 (46%)、咽拭子 (32%)、粪便 (29%)和血 (1%)。但是Peng等[33]的研究指出粪便和尿液样本病毒RNA 阳性时并不一定具备胃肠道和尿道症状。Wu等[35]的研究显示粪便样本对SARS-Co V-2核酸的阳性反应通常滞后于呼吸道样本,呼吸道病毒清除后患者消化道仍可能存在病毒复制。近期,越来越多的入境检测哨点开始采集肛拭子。这项举措在最近Lin等[36]的报道中找到了依据,该研究发现尽管肛拭子在病程早期采集的病毒载量低,但是肛拭子阳性的持续时间长,检测肛拭子能够帮助筛检持续排毒患者,有助于疫情防控。然而,上述两项研究也体现出了PCR 存在一定程度的假阴性率。总之,PCR 较NGS 流程简便、耗资较少、特异度高,根据核酸片段即可诊断,但是不同患者在不同病程阶段、不同样本间的一致性较差。不可忽视的是,不同类型的标本检测PCR 还具有监测病情变化和评估预后的潜在临床价值。

3.3 以影像学方法为主的临床诊断 胸部影像学技术,特别是胸部CT,能够在COVID-19病程早期敏感、客观地评估病变的性质和范围,监测病情变化。尽管COVID-19患者的影像学表现不具有明显的特征性,但是胸部CT 一直是其诊断的重要手段,特别是在疫情的特殊阶段。

2020年1月30日,WHO 宣布COVID-19为国际关注的突发公共卫生事件,疫情累及18 个国家或地区,境外82例感染,国内7 736例。2月4日国内确诊病例新增3 887例 (湖北3 156例),现存疑似病例23 260例,国内新增病例达到峰值,疫情在全国范围内短期快速播散,远远超出当时我国核酸检测能力。而且许多患者不具备流行病学史,这使得流行病学史与核酸检测在诊断中的作用下降。因此,2月4日,国家卫生健康委员会发布的 《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案 (试行第五版)》[37]强调了影像学诊断的重要性。在湖北以外,如果患者的影像学表现等相关临床证据均符合COVID-19特征,疑似病例的诊断则不再要求流行病学史,确诊病例仍要求PCR 或基因测序。而在湖北省内,有发热或呼吸道症状、血常规改变和流行病学史的两项可诊为疑似病例。在此基础上具备病毒性肺炎影像学特征即可作为临床诊断病例,具备病原学证据则诊断为确诊病例。Xie等[38]对177例确诊病例进行了回顾性研究,5例患者初次核酸检测阴性,但是胸部CT 具备COVID-19影像学的典型表现,7例患者PCR 呈阳性而影像学不具有病毒性肺炎的表现。Fang等[39]的回顾性研究纳入了51例确诊患者,其中50例胸部CT 有病毒性肺炎等异常表现,仅36例初次PCR 呈阳性,CT 的敏感度 (98%)显著高于PCR (71%)。钟南山院士团队在疫情早期的研究显示仍有17.9%的非重症患者和2.9%的重症患者影像学未见肺炎表现[24]。由此可见,影像学具有较高的敏感度,然而并非所有患者均具备典型影像学表现,单纯依靠PCR 或影像学诊断COVID-19并不严谨,2种诊断方法结合应用应该会更为准确。但在暂时缺乏核酸结果的情况下,影像学特征性表现与临床思维相结合可以明显提高的COVID-19 诊断水平。

3.4 分子生物学实验和血清学试验联合诊断 随着对病原体结构蛋白认识的不断加深和诊断方法的逐步完善,有学者认为血清学试验可以作为核酸检验的补充,血清学试验本身具备快速、简单、敏感、准确、稳定的特点,易于大规模开展和追溯既往感染。PCR 和血清学试验两者联合应用能提高敏感度。

Sun等[16]通过酶联免疫吸附试验分析了38例患者的血液样本,证实S蛋白和N 蛋白分别能够刺激机体产生特异性Ig G 和Ig M 抗体,并且联合监测S蛋白和N 蛋白的Ig G和Ig M 抗体阳性率在1周内可达75%,因此血清学试验有助于COVID-19的早期诊断。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案 (试行第七版)》[22]第一次提出进行确诊可以依据血清学证据,即血清SARS-Co V-2特异性Ig M 和Ig G 阳性及Ig G 的动态变化,结合临床疑似病例条件可以确定诊断,但也指出血清学不能单独作为COVID-19诊断依据。Zhao等[40]通过纳入173例患者纵向动态观察Ig M 和Ig G 的血清学转换,发生的中位时间分别为发病后12 d和14 d。

血清学试验不受呼吸道样本的不确定性影响,能够减少核酸检验中因采样、试剂盒质量、样本RNA 降解及检测的性能引起的假阴性,已经有多项研究报道患者PCR 出现假阴性而血清学试验呈阳性[41-42]。Li等[43]通过侧流免疫分析技术对39例确诊患者和128例非COVID-19患者进行血清学检测,结果显示Ig M 和Ig G 检测的总体敏感度为88.66%,特异度为90.63%。此外Pan等[41]应用胶体金免疫层析技术进行Ig M 和Ig G 联合检验,血清学试验的敏感度在1～7 d、8～14 d和15 d后分别为11.1%、92.9%和96.8%。而且该两项研究认为静脉血、指尖血、血清和血浆的检测结果具有良好的一致性[41,43]。上述研究显示,COVID-19患者发病早期核酸阳性率较高而后期下降,而血清学试验随着病程发展阳性率提高。尽管如此,在Mei等[44]报道的一项纳入651例康复患者的临床研究中,23例核酸复阳患者行抗SARS-Co V-2免疫球蛋白的胶体金免疫层析试纸检测,其中7例患者Ig M 和Ig G 均阳性,5例患者Ig G 阳性但Ig M 阴性,其余11例患者2种抗体均阴性。由此可见,血清学试验在长期的角度上并非完全可靠,因此,核酸检验和血清试验学联合诊断COVID-19 准确性较高。

4 结论和展望

研究人员借鉴先前的冠状病毒病原学的研究成果,及时开展SARS-Co V-2的病原学研究。新发病原体认识的不断完善促进了新的诊断方法的开发,同时更多的诊断方法在诊疗方案的更新中被采纳,提高了确诊标准的敏感度。单一的诊断方法难以准确地判断患者是否被SARS-Co V-2感染,因此对COVID-19患者进行确诊需要参考多种诊断方法。未来可以进一步深入病原学和感染机制研究,不仅能够为诊断方法提供更多参考,还能够推动疫苗和抗SARS-Co V-2药物的开发。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突